的；
薄层层析：将适当粒度的吸附剂铺成薄层，以纸层析类似的方法进行物质的分
离和鉴定；
2、根据移动相种类的不同：
气固层析(GSC)
液液层析(LLC)
气相层析
液相层析
气液层析(GLC)
液固层析(LSC)
3、吸按附层层析析的：机理利：用吸附剂表面对不同组分吸附性能的差异，达到分离鉴定
的目的；
分配层析：利用不同组分在流动相和固定相之间的分配系数不同，使之 分 离子离交；换层析：利用不同组分对离子交换剂亲和力的不同； 凝胶层析：利用某些凝胶对于不同分子大小的组分阻滞作用的不同。
2．加样
上样也有干法和湿法之分：干法就是把待分离的样品用 少量溶剂溶解后，在加入少量硅胶，拌匀后再旋去溶剂。如 此得到的粉末再小心加到柱子的顶层。干法上样较麻烦，但 可以保证样品层很平整。湿法上样就是用少量溶剂（最好就 是展开剂，如果展开剂的溶解度不好，则可以用一极性较大 的溶剂，但必须少量）将样品溶解后，再用胶头滴管转移得 到的溶液，沿着层析柱内壁均匀加入。加完后，用少量溶剂 把容器和滴管冲洗净并全部加到柱内，再用溶剂把粘附在管 壁上的样品溶液淋洗下去。慢慢打开活塞，调整液面和柱面 相平为止，关好活塞。如果样品是液体，可直接加样。
洗脱完毕，采用薄层色谱法对各收集液进行鉴定，或紫外 光检测，以洗脱液体积对被洗脱物质浓度作图，可得到洗脱 曲线把含相同组分的收集液合并，除去溶剂，便得到各组分 的较纯样品。
（四） 硅胶柱、大孔吸附树脂柱、聚酰胺柱
1、硅胶柱
ⅰ. 装柱
活化硅胶：100～110OC,0.5h； 层析主经长比：1：20～30； 样品与吸附剂比例：1：30～60； 沉降平衡。
常用的装柱方法有干装法和湿装法两种 （1）干装法
在柱内装入2/3 溶剂，在管口上放一漏斗，打开活塞让溶剂慢慢地 滴入锥形瓶中，接着把干吸附剂经漏斗以细流状倾泻到管柱内，同时 用套在玻璃棒（或铅笔等）上的橡皮塞轻轻敲击管柱，使吸附剂均匀 地向下沉降到底部。填充完毕后，用滴管吸取少量溶剂把粘附在管壁 上的吸附剂颗粒冲入面上液层高度降0.1~1cm，再把收 集的溶剂反复循环通过柱体几次，便可得到沉降得较紧密的柱体。 （2）湿装法
ⅱ.上样
干法：样品难溶于洗脱剂时，用少量适当溶剂拌适量硅胶溶解、挥干，上 柱；
湿法：样品溶于洗脱剂时。
ⅲ.洗脱：溶剂选择见下（洗脱剂的选择） ⅳ.常压与加压：硅胶粒度细时，为了保证洗脱速度可以适当加压。
2.大孔吸附树脂柱
大孔吸附树脂是一种具有大空结构的有机高分子共聚体，是一类人 工合成的有机高聚物吸附剂，因其具有多孔性结构而具有筛选性，又通 过表面吸附、表面电性或形成氢键而具有吸附性。
系数K： 是物质在两相中的浓度比。K值大，则在固定相中 吸附牢，K值小吸附差。各物质间的K值差别大，则易被分 离。不同类型层析的K值含义不同，可视为吸附平衡常数， 分配常数或离子交换常数等。
（三） 层析的分类
1、按操作形式：
柱层析：将固定相装于柱内，使样品沿一个方向移动而达到分离；
纸层析：用滤纸做液体的载体，点样后，用流动相展开，以达到分离鉴定的目
基本方法与干装法类似，所不同的是，装柱前吸附剂需要预先用 溶剂调成淤浆状，在倒入淤浆时，应尽可能连续均匀地一次完成。如 果柱子较大，应事先将吸附剂泡在一定量的溶剂中，并充分搅拌后过 夜（排除气泡），然后再装。其优点是一般柱子装的比较结实，没有 气泡。
无论是干装法，还是湿装法，装好的色谱柱应是充填均匀，松紧 适宜一致，没有气泡和裂缝，否则会造成洗脱剂流动不规则而形成 “沟流”，引起色谱带变形，影响分离效果。
不同物质分配系数不同时
不 同 组 分 的 含 量
上部
中部
下部
不同组分在柱中的位置
(二) 几个基本概念
如上图有：Vt＝Vo＋Vi＋Vg， 由于Vg相对很小，可以忽略不 计，则有：Vt＝Vo＋Vi。
外水体积是指凝胶柱中凝 胶颗粒周围空间的体积， 也就是凝胶颗粒间液体流 动相的体积。内水体积是 指凝胶颗粒中孔穴的体积， 凝胶层析中固定相体积就 是指内水体积。基质体积 是指凝胶颗粒实际骨架体 积。而柱床体积就是指凝 胶柱所能容纳的总体积。 洗脱体积是指将样品中某 一组分洗脱下来所需洗脱 液的体积。
装柱加样：同大空树脂。上样量约1.5~2.5g/100ml，上样药液浓度 20%~30%
洗脱：先用水洗，再用醇洗，醇浓度递增，直至无水乙醇或甲醇， 若仍有物质未被洗脱，可以用稀氨水或甲酰胺洗脱，分段收集。
三、柱层析常见问题与对策
柱层析成败的关键是选择合适的吸附剂、洗脱 剂和操作方式。
(一) 吸附剂的选择
分步洗脱：这种方法按照递增洗脱能力顺序排列的几种洗脱液，进行逐级洗 脱。它主要对混合物组成简单、各组分性质差异较大或需快速分离时适用。每次 用一种洗脱液将其中一种组分快速洗脱下来。
梯度洗脱：当混合物中组分复杂且性质差异较小时，一般采用梯度洗脱。它 的洗脱能力是逐步连续增加的，梯度可以指浓度、极性、离子强度或pH值等。最 常用的是浓度梯度。
层析柱分离物质的示意图
A 32
16
8
4
2
B
16
16
12
8
C
8
12
12
D
4
8
E
2
固定相为固体颗粒，装在层析柱内，高5cm，固定相周围充满液体流动相， 每厘米柱中液相体积为1cm3。若在柱顶加入1cm3溶剂,其中含32mg样品，同 时应有相同体积的溶剂从柱底流出，此时样品处于柱中A位置。若样品的分 配系数是1，则它在固相与液相间等量分配。若再有1cm3的溶剂加到柱上，A 部分中的溶剂带着16mg的物质向下移动到B，A和B中的物质都将发生再分配
以上划分无严格界限，有些名称相互交叉，如亲和层析应属于一种特殊的吸附层析，纸 层析是一种分配层析，柱层析可做各种层析。
二、柱层析的基本操作
（一） 原理
柱色谱一般有吸附色谱和分 配色谱两种。前者常用氧化铝和 硅胶作固定相，在分配柱色谱中 以硅胶、硅藻土和纤维素作为支 持剂，以吸收一定量的液体作固 定相，而支持剂本身不起分离作 用。实验室中最常用的是吸附色 谱。根据混合物中各组分对吸附 剂（即固定相）的吸附能力，以 及对洗脱剂（即流动相）的溶解 度不同将各组分分离。
柱层析简介
李正邦 2007-10.17
目录
层析的基本原理
☆层析的基本原理 ☆层析的基本概念 ☆层析的分类
柱层析的基本操作
☆原理 ☆几个基本概念 ☆基本操作步骤 ☆ 硅胶柱、大孔吸附树脂柱、聚酰胺柱
柱层析常见问题与对策
☆吸附剂的选择 ☆洗脱剂的选择 ☆操作方式
一、层析的原理
(一) 层析的基本原理
层析法（chromatography）又称色谱法，是利 用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、 分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使 各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一 相流过固定相，称为流动相）中的分布程度不同， 从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。
（二） 层析的基本概念

一般要求吸附剂具备以下条件：表面积大、颗粒均匀、吸附选择
性好、稳定性强和成本低廉等性能。

目前常用的吸附剂吸附极性化合物能力的顺序为：纸＜纤维素
＜淀粉＜糖类＜硅酸镁＜硫酸钙＜硅酸＜硅胶＜氧化镁＜氧化铝＜活
性炭。

在选择具体吸附剂时，主要是根据吸附剂本身和被吸附物质的理
化性质进行的。一般来说， 极性强的吸附剂易吸附极性强的物质，
注：
ⅰ.解析条件的确定要考虑： 解析剂(解吸附曲线，尖锐不拖尾)； 解析剂的PH； 解析速度(脱附曲线，流速慢，脱附效果好，但周期长)； 解析温度(一般升温有利于脱附，但可能使杂质混入洗脱液)。
ⅱ.影响上样吸附的因素 层析主选用不当(φ:L)； 装柱不当(送进均匀、顶端平整)； 药液处理不当(前处理、反洗、黏性)； 上样流速控制不当(快-吸附不完全，慢-效率低)； 树脂型号选用不当(动态吸附、静态吸附)。
3. 聚酰胺柱
聚酰胺是通过酰胺键聚合的一类高分子化合物，对碱较稳定而对酸不 稳定，其酰胺键可以与酚类、酸类、醌类和硝基化合物等形成氢键而被 吸附，从而与不能形成氢键的化合物分离。聚酰胺具有”双重色谱”的 性能：正向和反向分配色谱。常用于分离酚类、黄酮类、醌类以及脱鞣 处理等。
聚酰胺使用前必须预处理：过筛，再以90-95%乙醇浸泡，不断搅拌， 除去气泡后装入柱中。用3-4BV的90-95%乙醇洗脱，洗至洗脱液透明并 在蒸干后无残渣(或极少残渣)。再依次用2-2.5BV的5%NaOH水溶液、 1BV的蒸馏水、2-2.5BV的10%醋酸水溶液洗脱，最后用蒸馏水洗脱至 pH中性，备用。
对洗脱液接收时，有色物质，按色带进行收集，但色带 之间两组分会有重叠。对无色物质的接收，一般采用分等份 连续收集，每份流出液的体积毫升数等于吸附剂的克数。若 洗脱剂的极性较强，或者各成分结构很相似时，每份收集量 就要少一些，具体数额的确定，要通过薄层色谱检测，视分 离情况而定。现在，多数用分步接收器自动控制接收。
固定相：固定相是层析的一个基质。它可以是固体物质（如 吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可以是液体物质（如固 定在硅胶或纤维素上的溶液），这些基质能与待分离的化合 物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。
流动相：在层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一 个方向移动的液体、气体等，都称为流动相。柱层析中一般 称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。
一般粒度20～60目，分为非极性、中级性、极性、强极性。采用大 孔吸附树脂分离纯化中药的有效成分，应根据欲处理成分的理化性质考 虑以下因素：适合的树脂、树脂预处理、吸附溶质的浓度、吸附流速与 温度、解吸附剂种类、解吸附时流速与温度等。 ⅰ.树脂前处理
新购树脂中可能含有未聚合的单体、分散剂、致孔剂、引发剂、惰 性溶剂等化学残留，所以使用前必须进行预处理以保证最后药用安全。 一般方法：乙醇浸泡24h，连续加热回流数次(更换新溶剂)后湿法上柱， 用乙醇洗脱至流出液与水(1:2)混合不产生浑浊，再用水冲至无醇味，水 浸泡备用。注意不同型号树脂处理方法不同，请按照厂商提供方法处理。 ⅱ.装柱与上样