亳芍生物碱提取及含量测定作者周飞指导教师陈乃东摘要：用95%乙醇提取亳芍干粉，总提物回收乙醇后以盐酸酸化，继以二氯甲烷萃取，水相加氨水至pH ﹥8.0后以氯仿萃取，回收氯仿获粗提物。

对该粗提物的TLC检测表明，亳芍中含有生物碱，且可能是乌头碱类生物碱。

酸碱滴定法初步测定的生物碱含量，以乌头碱计，亳芍中总生物碱含量约为0.07%。

关键词：亳芍生物碱显色反应酸碱滴定The primary research of the extracting and assaying of the alkaloidsfrom Baishao Paeoniae Radix AlbaBachelor candidator Fei ZhouAdviser Nai-Dong ChengAbstract：Total extract was extracted from Root of herbaceous peony's dry powder by using95%alcohol.We recover alcohol from the total extract,then join hydrochloric acid,then usingmethylene chloride to extract.We join ammonia to pH﹥8.0in aqueous phase,then using chloroform to extract. We recover chloroform to get rough extract.TLC testing indicated that Baishao Radix Paeoniae Alba contains alkaloids,and the alkaloids may be aconitine class.Acid-base titration rough determination showed that Baishao Paeoniae Radix Alba content about0.07%total alkaloid with the aconitine represented.Key words：Baishao Paeoniae Radix Alba Alkaloids Color reaction Acid-base titration亳芍(Radix Paeoniae Alba)，即亳白芍，主产安徽省亳州地区，为安徽道地药材之一，是芍药科植物芍药(Paeonia lactiflora)或其变种毛果芍药(Paeonia trichocarpa)栽培品的根。

芍药为多年生草本植物，夏秋季采挖其根部，去净泥土和支根，沸水浸或略煮至受热均匀，再经晒干等处理后即炮制成中药亳芍，加工后的亳芍呈粉白色或白色。

亳芍具有抗炎、免疫调节、抗病毒、抗氧化、抗惊厥、护肝等作用，对胃肠道疾病和心血管疾病也有一定的疗效[1]。

已有的研究表明，亳芍主要含有单萜[2-7]、倍半萜及三萜[7,8]、单宁[9]、挥发油[10]、黄酮[8,11]、多酚类[13,14]、多糖[15,16]等活性成分，其中，芍药苷（一种单萜类化合物）是亳芍的主要活性成分[5,17-19]。

为了进一步揭示亳芍的药效物质基础，为开发利用亳芍资源、繁荣当地经济提供参考依据，我们对亳芍的化学成分进行了一次深入研究。

初步的定性鉴定研究结果表明，亳芍中含有生物碱。

到目前为止尚未有亳芍中含有生物碱的研究报道，为此，本文对亳芍生物碱的提取、定性鉴定以及亳芍生物碱含量的初步测定等进行了研究，为后续的亳芍生物碱的分离鉴定奠定基础。

1材料仪器试剂1.1材料实验材料亳芍购于安徽省亳州市，品种经安徽中医学院黄和平博士鉴定。

1.2仪器GJ14-DGF3006型电热恒温干燥箱（金坛市荣华仪器制造有限公司），HH-4型数显恒温水浴锅（金坛市国华电器有限公司），LX-02型利祥100g手提式粉粹机（上海江信科技有限公司），RE-52D型旋转蒸发器(上海浦沪仪器厂)，FA-1004型电子天平（上海精科天平厂），WD-9402E型紫外检测器（北京市六一仪器厂），TDL-5Z台式多管架自动平衡离心机（湖南星科科学仪器有限公司），冷凝管，漏斗，分液漏斗，碱式滴定管，250mL锥形瓶2个，150mL 锥形瓶5个，25mL量筒1个，50mL量筒1个，1mL移液管1个，5mL移液管1个，10mL移液管1个，250mL烧杯1个，50mL烧杯3个，100mL容量瓶1个1.3试剂无水乙醇(扬州沪宝化学试剂有限公司），氨水(扬州沪宝化学试剂有限公司），无水乙醚（扬州沪宝化学试剂有限公司），氯仿(西陇化工股份有限公司），二氯甲烷(西陇化工股份有限公司），乙酸乙酯(西陇化工股份有限公司），甲醇（河北四友卓越科技有限公司），冰醋酸（国药集团化学试剂有限公司），甲醛（无锡市展望化工试剂有限公司），浓硫酸(汕头市西陇化工厂有限公司），次硝酸铋，碘化钾（蚌埠化学试剂厂），浓盐酸(汕头市西陇化工厂有限公司），茚三酮，甲基红，溴甲酚绿，硫酸，氢氧化钠以上试剂药品均为国产分析纯。

2方法2.1工艺流程图本实验中亳芍总生物碱的提取工艺流程如下：2.2亳芍总生物碱的提取2.2.1干燥亳芍先剪成薄片状，然后粉粹，干燥箱中干燥至恒重。

2.2.2提取称取25g干燥至恒重的亳芍粉末，以95%乙醇、料液比1:4(g:mL)、85℃冷凝回流提取三次，每次提取4小时。

过滤，合并滤液，减压浓缩回收乙醇至提取液无醇味，浓缩液备用。

2.2.3纯化将在2.2.2中所获生物碱浓缩液加水适当稀释、定容，缓缓加入浓盐酸，使溶液中浓盐酸含量达5%（V/V），摇匀，待充分反应后4000转/min离心5分钟，弃去沉淀，上清液加等体积二氯甲烷萃取萃三次取除杂，水相备用。

2.2.4萃取向2.2.3所获水相中缓慢滴加氨水至溶液显碱性p H≧8.5（精密pH试纸测定），加入等体积氯仿萃取三次，合并氯仿相，减压回收氯仿，得亳芍总生物碱，加氯仿定容至100mL，平均分成2份，备用。

2.3亳芍生物碱的鉴定2.3.1薄层层析取一份总生物碱适当浓缩，在五块G254硅胶薄层板上分别点样，以乙酸乙酯：氯仿：甲醇：氨水=8:2:3:2系统为展开剂薄层层析。

2.3.2显色剂的配制(1)碘化铋钾显色剂的配制：0.85g次硝酸铋溶于10ml冰醋酸，加水40ml，8g碘化钾溶于20ml水，混匀后使用。

(2)甲醛浓硫酸显色剂的配制：30%甲醛溶液0.2mL与10mL浓硫酸混合均匀后使用。

(3)浓硫酸显色剂的配制：直接使用浓硫酸即可。

(4)浓硝酸显色剂的配制：直接使用浓硝酸即可。

(5)茚三酮显色剂的配制：1.5g茚三酮+100mL正丁醇+3.0mL醋酸，溶解混匀即可。

2.3.3紫外检测取出薄层板，吹干薄层板上的展开剂，分别在254nm和365nm紫外灯下照射，记录现象。

2.4亳芍生物碱的含量测定亳芍生物碱的测定，主要参照杨云[20]的方法改进而来。

取另一份亳芍总生物碱，用于测定含量。

亳芍总生物碱的含量测定的计算公式为：－V NaOH）×M×100%÷1000W生物碱总含量=C×(V空白在公式中：C是滴定用NaOH浓度，在本实验中C=0.02mol/L；V NaOH是滴定加入过量硫酸的生物碱所用NaOH体积；V空白是滴定相同浓度相同体积硫酸所用NaOH体积；M是代表生物碱的相对生物分子量，在本实验中选择乌头碱的分子量。

M=654.74为代表计算亳芍总生物碱的含量。

W是样品的质量，在本实验中W=25.8545g2.4.1指示剂的配制取0.1%甲基红的乙醇溶液20mL，加入0.2%溴甲酚绿的乙醇溶液30mL，摇匀，备用。

2.4.2有机试剂溶解精确吸取配制的亳芍总生物碱溶液液10mL，置水浴锅上蒸干，残渣加无水乙醇3mL，再加乙醚5mL，使之溶解.2.4.3滴定精密加入0.01mol/L硫酸10mL，摇匀，置水浴锅上加热，使之充分反应，放置冷却，加蒸馏水15mL和甲基红-溴甲酚绿指示剂2滴，用0.02mol/LNaOH溶液滴定至淡绿色即得，记录数据。

2.4.4空白对照在锥形瓶中精密加入相同浓度相同体积的硫酸溶液（0.01mol/L硫酸10mL），加蒸馏水15mL和甲基红-溴甲酚绿指示剂2滴，用0.02mol/LNaOH溶液滴定至淡绿色即得，记录数据。

3.结果3.1亳芍生物碱的显色鉴定结果亳芍生物碱的显色鉴定结果见表1及图1~7。

表.1亳芍生物碱总提物TLC检测结果[21]Table.1The identifications of alkaloids in Baishao Paeoniae Radix Alba by TLC显色剂检测依据检测结果结论碘化铋钾遇生物碱显橙红色4个橙红色斑点含有生物碱浓硫酸遇乌头碱显紫色2个紫红色斑点可能含有乌头碱类甲醛浓硫酸遇吗啡显橙色至紫色4个紫黑色斑点可能含有生物碱浓硝酸遇秋水碱显蓝色，遇咖啡碱不显色未见显色斑不含秋水仙碱茚三酮遇所有氨基酸及具有游离α-氨基的肽都会产生显色反应产生蓝紫色或（亮）黄色物质未见显色斑不含氨基酸、短肽等254nm紫外可观测到显色斑2个暗斑可能含有生物碱365nm紫外可观测到显色斑2个蓝色荧斑可能含有生物碱图1碘化铋钾显色图2浓硫酸显色图3甲醛浓硫酸显色图4浓硝酸显色Fig.1Colored by Fig.2Colored by Fig.2Colored by Fig.4Colored by Potassium DOVAP formaldehyde/DOVAP nitric acid Heptaiodobismuthate图5茚三酮显色图6254nm紫外下检测图7365nm紫外下检测Fig.5Colored by Fig.6Colored by UV254nm Fig.7Colored by UV365nmninhydrin3.2含量测定结果滴定样品消耗的NaOH的体积V NaOH=9.40mL，滴定空白对照消耗NaOH的体积V空白=9.55mL。

将相关数据代入公式计算亳芍总生物碱总含量=0.02mol/L×(9.55mL−9.40mL)×654.74g/mol÷(1000×25.8545g)×100%×10=7.5972×10-44讨论4.1亳芍生物碱的鉴定碘化铋钾是鉴定生物碱最常用的显色剂，如遇生物碱显橙红色。

在我们的实验条件下，采用碘化铋钾显色，亳芍总生物碱检测到四个明显的橙红色显色斑（图1），说明亳芍中含有生物碱。

但是一些含氮非生物碱物质如氨基酸等遇到碘化铋钾也会显色。