包涵体纯化与复性：色谱柱纯化包涵体包涵体纯化的方法与肝素有亲合力的包涵体的纯化包涵体纯化复性的一篇文章HIS包涵体的NI纯化包涵体的纯化和复性总结(精华呦)洗涤纯化的原理GST融合蛋白包涵体的纯化Amersham关于包涵体蛋白复性、纯化的报告包涵体提出、纯化、复性"必胜技"Pet28a/Bl21plys 表达体系包涵体的纯化GST融合蛋白的包涵体能过柱子纯化吗？含量低的目的蛋白的纯化包涵体的进一步处理包涵体直接纯化效果好还是复性以后纯化效果好?包涵体如何复性关于包涵体蛋白的复性，浓缩，纯化关于包涵体的提取方法制备多克隆抗体的蛋白是否需要除去尿素从包涵体中提纯蛋白有关包涵体的溶解问题包涵体的洗涤请教：菌体超声破壁时，所用的频率及时间是怎样的？另外应该菌体完全破壁时，菌液应该是怎样的？（也就是说超声的程度）xxz990913 wrote:请教：菌体超声破壁时，所用的频率及时间是怎样的？另外应该菌体完全破壁时，菌液应该是怎样的？（也就是说超声的程度）超声时所用的频率以及时间是跟你的表达菌的种类以及你目的蛋白的性质密切相关的。
比如说你的表达菌的承受能力比较强的话，你就可以适当加大超声频率以及超声时间，另外，比如说你的目的蛋白是以包涵体形式存在的话那么你就要注意你的超声力度了，因为很有可能对目的蛋白有很大的影响。
一般实验室的超声仪探头的最大承受频率大概也就是400W，所以可以选用300w，超声10s，停止10s，或是选用400w，超声5s，停止5s。
超声如果效果较好的话，整个样品应该是比较清亮的，但是并不是十分清亮，当然这跟你在湿菌体中加入pbs的量是有关系的，加多了，就清亮些，加少了，就浑浊些。
还有就是超声效果如果好的话，样品不会出现像原来的那种教粘稠的情况，因为长链核酸全部被打断了。
当然为了减小超声的负担，可以在超声前加入溶菌酶，反复冻融等步骤。
这也要根据宿主菌而确定。
20021108战友辛苦了很需要有你这样的热心战友！请教：蛋白质复性的具体步骤，我的目的蛋白溶解在20mM tris-hcl ,ph 7.2 0.5M Nacl, 复性缓冲液需要Tris缓冲液还是Pbs缓冲液？我用的是Pbs缓冲液，老是出现沉淀谢谢xxz990913 wrote:请教：蛋白质复性的具体步骤，我的目的蛋白溶解在20mM tris-hcl ,ph 7.2 0.5M Nacl, 复性缓冲液需要Tris缓冲液还是Pbs缓冲液？我用的是Pbs缓冲液，老是出现沉淀谢谢复性问题是表达蛋白过程中的一个很棘手的问题，因为氨基酸组成的不同，造成蛋白不同的性质，同时也使复性变得困难。
包涵体蛋白复性方法大概有如下几种：稀释复性、透析复性、超滤复性、柱上复性、高蛋白质浓度下的复性，此外，吸附法、反胶束法和双水相萃取法等都可用蛋白质的复性。
鉴于战友的情况，我个人认为应该使用Tris缓冲液较好，因为目前普遍认为大多数蛋白复兴使用Tris缓冲液效果较好（这可是有文献可查的哦）。
至于出现沉淀这一点是不用说的，再成功的复性也会出现沉淀，而且我觉得复性也可以看作是一个纯化的过程，我们期望看到沉淀，因为沉淀的不仅仅是我们的目的蛋白，还有一些杂蛋白，即使按比例沉淀，我们的目的蛋白还是越来越纯了，不是吗？而且这一点我认为战友没有必要担心，如果目的蛋白浓度过小的话，你可以在复性结束后浓缩一下以提高浓度。
当然如果目的蛋白全部沉淀的话，就说明这种缓冲液不适合你的目的蛋白，就要改变复性方案了。
影响复性效率的因素就有很多了，比如蛋白质的复性浓度、pH和温度等等等等。
这样的贴为什么不加分啊！！我强烈支持加分斑竹！！20021108衣带渐宽终不悔这是个好战友，希望以后能多请教！！biosepq wrote:20021108战友辛苦了很需要有你这样的热心战友！谢谢龙版的鼓励！vicardin wrote:这样的贴为什么不加分啊！！我强烈支持加分斑竹！！20021108衣带渐宽终不悔这是个好战友，希望以后能多请教！！谢谢战友您的鼓励！请教不敢当，互相学习吧。
加不加分没什么太大的关系，开设这个帖的主要目的是和大家共同探讨纯化和复性的经验、技巧等等。
斑竹也不是每时每刻都在线的，也许是还没阅帖吧，呵呵。
谢谢你们请问Tris缓冲液如何配制?急需谢谢你们请问Tris缓冲液如何配制?急需谢谢你们请问Tris缓冲液如何配制?急需xxz990913 wrote:谢谢你们请问Tris缓冲液如何配制?急需Tris缓冲液：50mM Tris0.5mM EDTA50mM Nacl5%或10％甘油如果有条件加入1％的甘氨酸或精氨酸和谷胱甘肽会更好些。
也可以在其中加入氧化还原系统，如双型谷胱甘肽、DTT等。
PH理论上是要根据你蛋白的等电点来确定的，应该是比等电点稍高一些。
但是PH7.9、8.0我都试过，效果没区别。
我曾经使用过PH 9.5成功复性目的蛋白天边的一片云wrote:我曾经使用过PH 9.5成功复性目的蛋白如上所述,缓冲液的PH是根据你的目的蛋白的等电点而确定的,呵呵.复性是一个十分复杂的过程，解决得方法也是多种多样。
首先是选择合适的表达载体和表达菌株，尽量少产生包含体。
可以先进行预实验确定表达条件，我建议采用正交分析法来进行。
一般的我采用4因素3水平的正交实验，因素主要考虑培养温度、诱导物加入量、加入诱导物时的菌浓度和诱导时间。
每个因素考虑小、中、大三个水平。
我曾经使用这种方法，很好的选择了一个蛋白的表达条件，使其大部分以可溶形式表达。
再谈包含体的复性，在采用通常的方法不行的条件下，可以考虑加入一些化学试剂，一般报道的有PEG、丁酸和多糖。
chinna wrote:复性是一个十分复杂的过程，解决得方法也是多种多样。
首先是选择合适的表达载体和表达菌株，尽量少产生包含体。
可以先进行预实验确定表达条件，我建议采用正交分析法来进行。
一般的我采用4因素3水平的正交实验，因素主要考虑培养温度、诱导物加入量、加入诱导物时的菌浓度和诱导时间。
每个因素考虑小、中、大三个水平。
我曾经使用这种方法，很好的选择了一个蛋白的表达条件，使其大部分以可溶形式表达。
再谈包含体的复性，在采用通常的方法不行的条件下，可以考虑加入一些化学试剂，一般报道的有PEG、丁酸和多糖。
这位战友说的是正确的.但是如果表达载体和表达菌一旦确定以后,想在根据温度、IPTG等来控制包涵体的形成我想并不是很现实，因为每次你加入的母液的浓度总是不一样的，即使是做成了，这种实验的可重复性也是比较差的。
因为不稳定性因素太多了，呵呵。
谢谢你们用Trition -100可以洗涤任何包涵体吗？会不会有什么影响？谢谢！xzyzb wrote:用Trition -100可以洗涤任何包涵体吗？会不会有什么影响？谢谢！曲拉通是一种表面活化剂，润湿及洗涤剂。
在洗涤包涵体的时候是把它当作洗涤剂来用的，也就是主要是把它当作一种去垢剂，用它来洗涤一些杂质或是分子量很大的一些杂蛋白。
不能说可以洗涤任何包涵体，因为“任何”包括的太多了。
但是我想绝大多数的包涵体还是可以用曲拉通来洗涤的，我也曾经试过用PBS来当作曲拉通来洗涤，效果也还可以，所以说曲拉通的洗涤只是一个可有可无的过程，对于整个包涵体蛋白的纯化来说不是很主要的一个过程。
看了些资料，发到自己的帖子上面，呵呵。
菌体/细胞裂解法：一、反复冻融法：1、将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。
2、至少3次以上冻溶。
3、IFCC推荐法：收集细胞悬液，4℃低温离心（3000rpm，5min），弃上清，加入一定量PBS（200ul），轻轻吹打混匀，-200C 冷冻30 min，370C 解冻，如此反复3次，可形成细胞裂解液。
步骤如下：1）收集细胞悬液2）40C 低温离心（3000rpm，5min）3）弃上清，加入一定量PBS（200ul），轻轻吹打混匀，-200C 冷冻30 min，370C 解冻，如此反复3次，可形成细胞裂解液。
4、用液氮冻融三四次就可以了，细胞冻住后，取出放37度水浴，溶解后震荡，再冻二、超声波处理法1、要设定好超声时间和间隙时间，一般超声时间不超过5秒，间隙时间最好大于超声时间，这些都有利于保护酶的活性。
我的实验超声时间5秒、间隙时间10秒、工作次数20次。
注意事项：1）、一个细胞超声仪可以配备不同尺寸的探头，根据你实验中收集细胞的容器大小选择合适规格的探头。
2）、另外冰浴非常重要，空化效应会局部产热，从而使细胞内酶失活，所以我通常将收集细胞的离心管置于冰盒中。
3）、要设定好超声时间和间隙时间，一般超声时间不超过5秒，间隙时间最好大于超声时间，这些都有利于保护酶的活性。
我的实验超声时间5秒、间隙时间10秒、工作次数20次，镜下观察细胞破碎效果很好，供参考。
不同细胞实验条件得具体摸索。
4）、最后好好看仪器说明书，探头到液面下的距离及与容器底部的距离都有要求。
2、每个样本超声时间5秒,每个间隔5秒,粉碎5次。
3、100ml菌液离心，用8ml缓冲液悬浮，加8mg溶菌酶，冰浴30min，然后超声处理。
750W 40％功率。
5秒超声，9秒间隔。
超声至少90min。
超声完毕后，菌液应该是澄清的，略显油状。
4、综合冻融和超声的方法：1500g离心，弃除上清。
冰上，用小体积PBS重悬细胞。
将重悬液集中，1500g离心浓缩，弃除上清。
液氮骤冷。
用约5倍体积的PBS缓冲液重悬细胞，并搅拌。
可选择：4℃下超声破碎细胞。
加入终浓度为0.25M的KCl，15mM的DTT。
4℃下111500g×60min离心裂解液。
取出上清。
过柱子。
三、渗透法：冰冷的20 mmol/L Tris-Cl（pH8.0），2.5 mmol/L EDTA处理，冰浴放置10min。
《精编分子生物学实验指南》四、裂解液处理法：1、细胞裂解液：50 mmol/L Tris-Cl pH 6.8，100 mmol/L DTT，2% SDS，0.1%溴酚蓝，10%甘油。
SDS是阴离子型表面活性剂、极易促溶、强变性作用。
2、在loading buffer加SDS，100度5分钟，是变性方法。
SDS与蛋白等量结合，可以通过条带位移判断蛋白大小，考染不会影响结果。
3、如果是做小量菌液，跑PAGE胶看其表达情况的话，可以直接加蛋白loading buffer 煮沸5分钟即可，需注意的是上样前要离心12000rpm至少5分钟，然后上样时，枪头别吸最底下的。
4、20毫升细胞裂解液配方:40 μL 0.5M EDTA (PH8.0)，4 ml 10% SDS，1 ml 1M Tris-cl(PH6.8)，14.96 ml 蒸馏水。
可以适当加入几种蛋白酶的抑制剂，如PMSF，leupeptin等。