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5、以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物 活性，必须通过有效的变性复性操作，才能回收得到 具有正确空间构象（因而具有生物活性）的目标蛋白， 体外复性蛋白质的成功率相当低，一般不超过30%。
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四、包涵体破菌、分离、洗涤、溶解
1 、破菌 基因工程菌发酵液，经离心浓缩后，可用：
机械破碎、超声破碎。单纯超声破碎，在小规 模下且菌量较少的情况下效果较好，由于能量 传递和局部产热等原因，很难用于大体积细胞 悬液的破碎，这样部分未破碎细胞与包涵体混 在一起，给后期纯化带来困难。因此，在较大 规模纯化时先用溶菌酶破碎细菌的细胞膜，再 结合超声破碎方法，可显著提高包涵体的纯度 和回收率。
Cyanase,表达产率达菌体蛋白的30%,也不形成包涵体，
而以可溶形式出现。

6 、在细菌分泌的某个阶段，蛋白质分子间的离子
键、疏水键或共价键等化学作用导致了包涵体的形成。
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三、包涵体表达的有利/有害因素：
1、可溶性蛋白在细胞内容易受到蛋白酶的攻击，包 涵体表达可以避免蛋白酶对外源蛋白的降解。 2、降低了胞内外源蛋白的浓度，有利于表达量的提 高。 3、包涵体中杂蛋白含量较低，且只需要简单的低速 离心就可以与可溶性蛋白分离，有利于分离纯化。 4、对机械搅拌和超声破碎不敏感，易于破壁，并与 细胞膜碎片分离。
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2 、分离 5000-20000g15min离心，可使大多数包涵体沉
淀，与可溶性蛋白分离。
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3 、洗涤 包涵体沉淀中主要含有重组蛋白，但也含有一些细菌成
分，如一些外膜蛋白、质粒ＤＮＡ和其它杂质。由于这 些脂体及部分破碎的细胞膜及膜蛋白与包涵体粘连在一 起，所以在溶解包涵体之前要先洗涤。洗涤常用低浓度 的中性去垢剂，如Tween、Triton、Lubel和 NP40等加 EDTA和还原剂二硫苏糖醇（DTT）、β-巯基乙醇等， 因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度升高而加强，在洗涤 包涵体时可加50 mM NaCL。这样提取的包涵体纯度至 少可达50%以上，而且可保持原结构。
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也可用低浓度的盐酸胍或尿素/中性去垢剂 /EDTA/还原剂等洗去包涵体表面吸附的大部 分不溶性杂蛋白。洗涤液pH以与工程菌生理 条件相近为宜，使用的还原剂为0.1-5mM。 EDTA为0.1-0.3 mM。去垢剂如Triton X-100、 脱氧胆酸盐和低浓度的变性剂如尿素充分洗涤 去除杂质，这一步很重要，因为大肠杆菌外膜 蛋白Omp T(37 KDa)在4-8mol/L尿素中具有蛋 白水解酶活性，在包涵体的溶解和复性过程中 可导致重组蛋白质的降解。
胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。

4 、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由
于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类和辅助因
子，如折叠酶和分子伴侣等，致使中间体大量积
累，容易形成包涵体沉淀。
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5 、蛋白质在合成之后，于中性pH或接近中性pH
的环境下，其本身固有的溶解度对于包涵体的形成比较
关键，即是说，有的表达产率很高，如Aspartase和
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二、包涵体形成的原因

包涵体形成的原因主要因为在重组蛋白的表达过
程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，
无法形成正确的次级键等原因形成的。具体的原因可
能有以下几点：
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1 、基因工程菌的表达产率过高，超过了细菌正常
的代谢水平，由于细菌的δ因子的蛋白水解能力达到饱
和，使之表达产物积累起来。研究发现在低表达时很少
形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。原因可能
是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二
硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫
氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明
显与包涵体的形成呈正相关。

3 、重组蛋白所处的环境：发酵温度高或
包涵体的纯化
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一、包涵体的定义
包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成 无活性的固体颗粒。一般含有50%以上的重组蛋白， 其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白 ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA， 以及脂体、脂多糖等。
大小为0.5-1um，具有很高的密度（约1.3mg/ml）， 无定形，呈非水溶性，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍 等。
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用超声波破碎法在处理过程会产生大量的热， 应采取相应降温措施，时间以及超声间歇时间、 超声时间可以自己调整，超声完全了菌液应该变 清亮，如果不放心可以在显微镜下观察。对超声 波及热敏感的蛋白和核酸应慎用。
此外还有高速组织捣碎法，玻璃匀浆器匀 浆 ，反复冻融法 ，化学处理法 。
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无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋 白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解， 导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP） 可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活 性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰 氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全 部，而且应该在破碎的同时多加几次；另外，还可通过 选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于 目的物质的提取。
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实验室用的是低浓度的变性剂—2M尿素在 50mM Tris pH8.0，1mM EDTA中洗涤和用温 和去垢剂1% TritonX-100洗涤去除膜碎片和膜 蛋白。
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4 、溶解 变性蛋白只有空间构象的破坏，一般认为蛋白质 变性本质是次级键、二硫键的破坏，并不涉及一级 结构的变化。包涵体的溶解主要任务是拆开错配的 二硫键和次级键 。
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变性作用是蛋白质受物理或化学因素的影响，改变其 分子内部结构和性质的作用。一般认为蛋白质的二级 结构和三级结构有了改变或遭到破坏，都是变性的结 果。能使蛋白质变性的化学方法有加强酸，强碱，重 金属盐，尿素，乙醇，丙酮等；能使蛋白质变性的物 理方法有加热，紫外线照射，剧烈振荡等。 重金属盐 使蛋白质变性，是因为重金属阳离子可以和蛋白质中 游离的羧基形成不溶性的盐，在变性过程中有化学键 的断裂和生成，因此是一个化学变化。