2、杂交过程： （1）组织或细胞的固定
理想固定液应具备： • 保持组织细胞的形态 • 对核酸无抽提，修饰与降解作用 • 不改变核酸在组织细胞内的定位 • 不阻碍核酸与探针的杂交过程 • 对杂交信号无遮蔽作用 • 理化性质稳定
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Southern 杂交(Southern bloting)的主要步骤
待测DNA样品的制备、酶切 待测DNA 样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳 凝胶中DNA的变性：碱变性 Southern转膜：
• 硝酸纤维素(NC)膜、尼龙膜 • 毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法
探针的制备 Southern杂交 杂交结果的检测
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Northern印迹与Southern 印迹的不同点
1、变性：RNA电泳前加热变性、电泳时加变性剂保 持RNA处于变性状态，DNA电泳前和电泳 中不变性
与Southern印迹杂交不同之处： RNA电泳 避免单链RNA自身形成高级结构和自身降解
变性凝胶电泳(甲醛、尿素、甲酰胺等)
RNase抑制环境
核酸分子杂交（DNA/DNA or DNA/RNA）
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核酸分子杂交技术：
具一定同源性的两条(DNA或RNA) 单链在适宜的温度及离子强度等条件下, 可按碱基互补配对原则特异性地复性， 形成双链。
探针(已知核酸片断，单链)
待测核苷酸序列(单链)
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核酸分子杂交技术，是在1968年由华盛 顿卡内基学院（Carnegie Institute of Washington）的Roy Britten及其同事发明的。 所依据的原理是，带有互补的特定核苷酸序 列的单链DNA或RNA，当它们混合在一起 时，其相应的同源区段将会退火形成双链的 结构。
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（a）
基因组DNA
DNA限制片段
（b）
（c）
（d） 硝酸纤维素滤膜
同探针同源杂交的基因
DNA片段
（e）
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X光底片
DNA凝胶电泳
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Southern DNA 印迹杂交之X光显像图片
水稻（Oryza sativa L.)的叶绿体DNA分别用核酸内切限制酶BglⅡ(A-C)、 BamHⅠ（D-F）、EcoRⅠ（G-I）、和HindⅢ（J-L）消化，加样在含有 EtBr染料的1%的琼脂糖凝胶电泳中作电泳分离，然后同32P标记的玉米 psbA探针作Southern杂交。X光底片中显现的阳性条带 ，表明含有水稻 的psbA基因序列
* 因这种方法与Southern blot杂交技术十分类似，与DNA的 杂交（Southern 杂交）相对应，被趣称为Northern杂 交。
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Northern印迹杂交 1、基本原理和基本过程与Southern blot基本相同 2、鉴别RNA 3、探针可用DNA或RNA片段 4、待测样品为总RNA或mRNA
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2、转膜：RNA转膜前不需变性和中和处理,Southern 印迹时，DNA转膜前需进行碱变性及中和处理
3、靶核酸为RNA
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27Βιβλιοθήκη Western 杂交印迹法(Western bloting)
检测蛋白质，即将电泳分离的非标记蛋 白质转移到固相载体上，用特异的抗血 清对蛋白质进行鉴定及定量的方法
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影响杂交的因素
核酸分子的浓度和长度
• 浓度大，复性快；分子量大，复性慢
温度 离子强度 杂交液中的甲酰胺 核酸分子的复杂性 非特异性杂交反应
• 预杂交：封闭非特异性杂交位点，用鲑鱼精子DNA
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分子杂交的基本方法
Southern 印迹法 Northern 印迹法 Western 印迹法 原位杂交 斑点印迹杂交 液相杂交
将标记的核酸探针与固定在细胞或组织中的核酸进行 杂交，称原位杂交。根据检测物分细胞内原位杂交和 组织切片内原位杂交；根据探针与待检核酸分： DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA 杂交。
特点 • 能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究 • 不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的靶序 列灵敏度高 • 能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态
主要步骤：
• 蛋白质样品的制备 • SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳 • 蛋白质的电转移：NC膜 • 靶蛋白的免疫学检测
靶蛋白于第一抗体（一抗）反应 与标记的第二抗体（酶标二抗）反应 显色反应：酶促反应
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In Situ Hybridization
原位杂交
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原位杂交(in situ hybridization)
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利用非放射性探针检测核苷酸
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主要应用 • 1.遗传病诊断 • 2.DNA图谱分析 • 3.PCR产物分析
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Northern blot
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Northern杂交
* 1979年，J. C. Alwine等人发展而来，是将RNA分子从电泳 凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤 纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。 也称为Northern印迹（Northern Blot），用以检测某 一特定的RNA（通常是mRNA）片段的存在及表达量。
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Southern DNA印迹杂交
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Southern DNA印迹杂交
使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结 合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单链 DNA或 RNA探针的杂交作用检测这些被转移 的DNA片段，这种实验方法叫做DNA印迹杂 交技术。由于它是由英国人Edwin Mellor Southern于1975年首先设计出来的，故又叫 Southern blot。
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核酸分子杂交的基本原理
DNA变性
• 方法
热变性：90~100℃ 酸碱变性：常采用碱变性 化学试剂变性：尿素、甲酰胺、甲醛等
• 特点：粘度增加、密度增加、增色效应、溶 解温度(melting temperature,Tm)
DNA复性或杂交(hybridization)
• DNA/DNA,DNA/RNA,RNA/RNA等
* 细胞或染色体的原位杂交，用于基因定位。
* 细菌菌落的原位杂交：筛选阳性克隆。
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原位杂交 1、定义：将标记的核酸探针与固定在细胞或组
织中的核酸进行杂交，称原位杂交。根据检测物分 细胞内原位杂交和组织切片内原位杂交；根据探针 与待检核酸分：DNA/DNA、RNA/DNA、 RNA/RNA 杂交
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