(1) 基因组DNA探针 (2) cDNA探针 (3) RNA探针 (4) 寡核苷酸探针
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合成寡核苷酸探针注意原则
(1) 长度（10-50 bp); (2) G:C对含量40%-60%； (3) 探针内避免互补； (4) 避免同一碱基连续出现； (5) 与非靶序列有70%以上同源性或连续
8个以上碱基序列相同，最好不用。
第八章
分子杂交技术
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第一节 分子杂交的原理
核酸分子杂交（nucleic acid hybridization） 指具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下按
碱基配对原则形成双链的过程。
分子杂交是通过配对碱基对之间的非共价键（
主要是氢键）结合，从而形成稳定的双链区。
杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序
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变性
复性
DNA-DNA 杂交双链分子
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杂交过程是高度特异性的,可以根据所使
用的探针已知序列进行特异性的靶序列
检测。
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一、DNA变性与复性
（一）DNA变性
1、定义：某些理化因素导致两条DNA链间 的氢链断裂变为单链的过程，称DNA变性
2、变性的方法： （1）热变性：温度升高到90~100℃时，双链
完全互补，所以不同来源的核酸单链只要彼此
之间有一定程度的互补顺序（即某种程度的同
源性）就可以形成杂交双链
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不同来源的DNA或RNA单链在一定条件下 重新组成的新的双链分子——杂交分子
若所用的核酸探针的片段较长(几百个核苷 酸以上)，可以得到很准确的鉴定结果。 但若人工合成的寡核苷酸探针片段较短 （如20～30个核苷酸），则难免会出现 准确性差的假阳性现象。
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按待测核酸是否固定在固相支持物上分： 固-液相杂交
膜上印迹杂交 原位杂交 液相杂交
RNA酶保护分析法 核酸酶S1保护分析法
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一、Southern杂交
其基本原理是将待检测的DNA样品固定在固相 载体上，与标记的核酸探针进行杂交，在与探 针有同源序列的固相DNA的位置上显示出杂交 信号。通过Southern杂交可以判断被检测的 DNA样品中是否有与探针同源的片段以及该片 段的长度。
注意：处理人类基因组DNA≤10分钟；处理植 物基因组DNA≤20分钟。
链重新解离
（3）局部双链周围的碱基如配对，则形成 中心序列
（4）形成完整的双链分子
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二. 分子杂交的一般程序
待测核酸制备
电泳
制备探针核酸片段
滤膜上核酸固化
探针标记
杂交
加入标记核酸探针
去除未参与杂交的探针
检测杂交信号
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制备DNA或RNA样品→与固定基质结合 →80℃真空固定→预杂交→加入标记探针杂交→ 洗涤→放射自显影或显色反应。
杂交的双方是待测核酸和已知核酸序列， 已知核酸序列称探针。
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杂交的双方：探针和要检测的核酸。
将核酸分子固定在固相支持物上，然后用标记 的探针和被固定的分子杂交，经显影后显示出 目的DNA或RNA分子所处的位置。
被检测的核酸：
克隆化的基因组DNA 提纯的
细胞总DNA 细胞总RNA
细胞内杂交（细胞原位杂交）
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三、 核酸探针的制备
探针（Probe)的概念:
一段带有检测标记的与目的基因或目 的DNA特异互补的已知核苷酸序列。
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1.探针的制备方法
长度一般以50~300bp为宜，有时达1.5kb。 制备方法：
(1) DNA重组技术 (2) PCR扩增 (3) 化学合成
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2. 探针的分类
据来源及性质不同可分为：
核酸 分子链间的氢键完全断裂。
（2）酸碱变性：pH值低于3或高于10时，双 链核酸分子链 间的氢键断裂。
（3）化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛 等使 双链核酸分子链间的氢键断裂。
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GC含量与Tm值之间的关系 （G+C）%=（Tm-69.3) ×2.44 Tm =(G+C)%×0.41+69.3
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（二）复性
1、定义：变性的单链核酸分子在一
定条件下按碱基互补原则重新结合为双
链核酸的过程，称复性或杂交。
具有互补序列的两条单链核酸都可互补 形成双链：
DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA、 寡核苷酸/DNA和寡核苷酸/RNA。
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2、复性过程 （1）单链分子间碰撞形成局部双链 （2）局部双链周围的碱基如不配对时，双
凝胶 滤膜
转膜
吸附有DNA 片段的膜
杂交、显影
Southern
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印迹杂交的技术流程
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（一）待测核酸样品的制备 1、裂解或破碎细胞 2、抽取纯化基因组DNA 3、限制酶消化DNA为大小不同的DNA片段
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（二）待测DNA样品的电泳分离
所用分子量标准可用核素标记，杂交后的标准分子量 DNA也能显影出条带。
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3 . 核酸探针的标记
为确定探针是否与相应基因组DNA杂交，有必要 对探针加以标记，以便在结合部位获得可识别的信 号。
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标记的种类
同位素： 32P、35S、3H、125I等标记探针 非同位素： 生物素、地高辛配体、荧光素等作为标记物
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第二节 核酸分子杂交的方法
按其分子种类划分 （1）Southern印迹杂交 （2）Northern印迹杂交 3） Western印迹杂交
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（三）凝胶中核酸的变性（碱变性）
分子量超过10kb的较大的DNA片段，需要很长 的转移时间。必须将最长的DNA片段控制在大 约2kb以下。
如果靶序列>5kb，则需进行脱嘌呤处理（ DNA 产生缺口将提高转移的质量）。
把凝胶浸在0.25mol/LHCl中，室温轻轻晃动， 直到溴酚蓝从蓝变黄。
(2) 将DNA片段转移到固体支持物(硝酸纤 维素滤膜或尼龙膜)上。
(3) 预杂交滤膜,掩盖滤膜上非特异性位点。 (4) 让探针与同源DNA片段杂交,然后漂 洗除去非特异性结合的探针。
(5) 通过显影检查目的DNA所在的位置。
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限制性酶切割
限制片段
DNA分子
琼脂糖电泳
带有DNA片段的凝胶
用缓冲液转移DNA 至膜（尼龙膜或硝酸 纤维素滤膜）上
DNA经电泳后，从凝胶中转移到硝酸纤维素滤 膜或尼龙膜上，然后与探针杂交。被检对象为 DNA，探针为DNA或RNA。
利用这一技术可进行克隆基因DNA的酶切图
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
谱分析，基因组中某一基因的定性与定量分析
、基因点突变及限制性片段长度多态性分性等
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步骤：
(1)酶切DNA, 凝胶电泳分离各酶切片段,然 后使DNA原位变性。