诱变和筛选方法在微生物育种中的应用
摘要: 本文综述了近年来国内微生物育种研究中理化因子等诱变方法和一些筛选方法的应用,并略述了理化诱变因子的诱变效应机制,以及这些诱变和筛选方法在科研和生产中的重要作用.
关键词:诱变筛选理化因子
引言
微生物育种的目的就是要人为地使某些代谢产物过量积累,把生物合成的代谢途径朝人们所希望的方向加以引导,或者促使细胞内发生基因的重新组合优化遗传性状,获得所需要的高产、优质和低耗的菌种.为达到这一目的,必须对微生物作诱变处理.在这一过程中,诱变和筛选是微生物育种的两个主要环节.目前, 国内微生物育种界主要采用的仍是常规的理化因子等诱变方法以及对目标菌株的筛选与检出方法.
一·诱变方法
1. 物理因子诱变
1.1紫外(UV)
DNA和 RNA的嘌呤和嘧啶有很强的紫外光吸收能力,最大的吸收峰在 260nm 紫外辐射能作用于DNA ,因此在260nm的紫外辐射是最有效的致死剂. 对于紫外的作用已有多种解释 ,但研究的比较清楚的一个作用是使 DNA 分子形成嘧啶二聚体,即两个相邻的嘧啶共价连接.二聚体出现会减弱双键间氢键的作用 , 并引起双链结构扭曲变形 ,阻碍碱基间的正常配对,从而有可能引起突变或死亡.二聚体的形成 ,会妨碍双链的解开,因而影响DNA的复制和转录.紫外辐射可以引起转换、颠换、移码突变或缺失等.
紫外线是常用的物理诱变因子,是诱发微生物突变的一种非常有用的工具. 由于 UV 的能量比X-射线和γ-射线低得多,在核酸中能造成比较单一的损伤, 所以在 DNA 的损伤与修复的研究中,UV也具有一定的重要性.
1.2 低能离子
低能离子生物学是我国首创的研究领域.离子注入生物体既存在能量、动量交换过程,又存在粒子沉积过程. 而动量、能量和质量三种作用都有其不同的生物学效应.离子注入与生物体相互作用存在峰值. 在峰值范围内,注入离子与生物体相互作用是局部的、双重的和不易修复的.在离于注入过程中,生物分子将吸收能量 , 经历着复杂的物理和化学的变化,这些变化的中间体是各类自由基. 所产生的活性自由基,能引起其它正常生物分子的损伤.可使细胞中的染色体畸变,DNA链发生断裂,也可使质粒DNA造成断裂点.由于低能离子在微生物诱变育种中的高效 ,它正在得到越来越广泛的应用.而且因为离子注入射程的可控性 , 随着微束技术和精确定位技术的发展 ,定位诱变将成为可能.
1.3 γ-射线
γ-射线属于电离辐射,是电磁波.一般具有很高的能量,能产生电离作用, 因而直接或间接地改变DNA结构.其直接效应是,脱氧核糖的碱基发生氧化,或脱氧核糖的化学键和糖 - 磷酸相连接的化学键,DNA的单链或双链键断裂.其间接
效应是电离辐射使水或有机分子产生自由基,这些自由基与细胞中的溶质分子起作用 , 发生化学变化,作用于DNA分子而引起缺失和损伤.此外,电离辐射还能引起染色体畸变,发生染色体断裂,形成染色体结构的缺失、易位和倒位等.电离辐射通常用于不能使用其他诱变剂的诱变过程.γ- 射线是电离生物学上应用最广泛的电离射线之一,实际应用的电离辐射还有X - 射线、β- 射线和快中子等.
1.4激光
激光是一种光量子流 ,又称光微粒.激光辐射可以通过产.生光、热、压力和电磁场效应的综合应用.直接或间接地影响有机体,引起细胞DNA或 RNA.质粒. 染色体畸变效应,酶的激化或钝化,以及细胞分裂和细胞代谢活动的改变.光量子对细胞内含物中的任何物质一旦发生作用,都可能导致生物有机体在细胞学和遗传学特性上发生变异. 不同种类的激光辐射生物有机体,所表现出的细胞学和遗传学变化也不同作为一种新的诱变源,激光以其高亮度、高方向性、高相干性以及单色性 , 在微生物育种领域已得到广泛应用.而且,不同种类的激光辐照微生物,所表现出的细胞学和遗传学变化也不同,这也给微生物诱变育种提供了便利条件.
1.5 空间条件、磁场、高温
国家开展863高技术航天领域空间诱变育种的研究,取得了很好的成绩.空间环境具有强辐射、微重力、高洁净、高真空等特点,有诱发突变的因素.在空间生命科学领域中 , 微重力和宇宙射线的生物学效应,是最重要的.宇宙射线作用于生物体的最直接效应是引起生物体内发生电离,产生许多次高能电子和自由基,自由基对生物大分子造成损伤,使生物产生变异病变,组织损伤致死等效应.
磁场及高温等诱变方法在微生物育种中也有运用,但并不很多.
2．化学因子诱变
化学诱变剂是一类能和DNA 起作用而改变其结构 , 并引起DNA变异的物质. 其作用机制都是与 DNA 起化学作用,从而引起遗传物质的改变,因而诱变效应与其理化特性有很大关系.
2.1烷化剂
NTG是最有效,也是用得最广泛的化学诱变剂之一.依靠NTG诱发的突变主要是 GC— AT转换,另外还有小范围切除、移码突变及 GC对的缺失.在自然条件下NTG容易分解,而在酸性(PH5. 5)条件下会产生 HN02.虽然 HNO2 本身就是诱变剂,但在NTG有活性时(PH6～9),它却无诱变效果.在碱性条件下,NTG会形成重氮甲烷(CH2N2),它是引起致死和突变的主要原因. 它的效应很可能是CH2N2 对DNA 的烷化作用引起的，另外,烷化剂中的EMS和DES,也是应用较为广泛的诱变剂。
2.2其它
除烷化剂外,常用的化学诱变剂还有嵌合剂,如吖啶橙;碱基类似物，如 52溴尿嘧啶(5 -Bu) ;以及抗生素类等.总之,化学诱变剂在微生物育种中的应用较多,有的诱变效果也较为理想.但因其对人体的致畸致癌作用,实际应用中也受到一定的限制.
3.复合因子诱变
复合诱变包括两种或多种诱变剂的先后使用;同一种诱变剂的重复作用;两种或多种诱变剂的同时使用.普遍认为,复合诱变具有协同效应.如果两种或两种以上诱变剂合理搭配使用,复合诱变较单一诱变效果好.复合因子较单一因子诱变效果有很大优势.但因目前大多微生物,尤其是抗生素产生菌的遗传背景不清
楚,往往对诱变剂,特别是复合诱变剂的选择使用,带有很大的盲目性.
二·筛选方法
1.初筛和复筛
除了诱变过程的最适条件外,突变菌株的分离和筛选也是微生物育种的关键环节.筛选一般分初筛和复筛两个阶段。
初筛可在摇瓶中完成,也可采用琼脂块法,即将适宜的反应试剂喷涂在平板上正在生长的菌落中,或采用混合指示剂在培养基上染色,直接观察特定的酶活性,或者将待测菌落打落,放置在涂有特定菌的检定盘上,依抑菌圈的大小定量测定菌株的抗菌活性物质的含量.初筛得到的高产菌株,再进行摇瓶复筛,对其生产性能作更精确的定量测定.
2．随机筛选和定向筛选
在初筛阶段进行的高产菌株的检出方法又有随机筛选和定向筛选之分.随机筛选具有很大的盲目性,且工作量很大.定向筛选常用来筛选抗性突变株和营养缺陷型突变株,其筛选效率远高于随机筛选.
2.1抗性突变株的筛选
抗性突变包括抗代谢产物,抗代谢类似物 ,抗噬菌体,抗前体及其类似物, 抗重金属离子或抗特定的有毒物质,抗培养基中的某些成分等.代谢产物等的积累,往往对其自身的合成具有反馈调节作用,筛选的抗性突变株,可以消除这些不利因素的抑制或阻遏作用,达到积累目的产物的作用.这些方法在抗生素生产中尤为重要,抗生素产生菌的抗性基因与抗生素合成的结构基因和调控基因紧密联锁而易发生共突变.在抗生素菌种选育中,抗性突变株往往就是高产突变株.
2.2营养缺陷型的筛选
营养缺陷型的本质是一种减低或消除末端产物以解除反馈抑制,使代谢途径中的中间产物或分枝合成途径中的末端产物得以积累.微生物育种中的筛选环节极为繁杂,工作量很大.同时,代谢产物生产能力强弱是数量性状,数量性状是微效多基因与环境条件相互作用的结果.由于发酵条件的不稳定性,发酵及测定操作中的人为误差,使得准确筛选的困难很大.如果建立起自动化测量等工作,效率及准确率将会大大提高.目前,重组 DNA 和原生质体融合等方法已用于菌种选育,但用于大规模生产的还不多,常规的诱变和筛选方法在微生物育种工作中仍占主导地位.
参考文献
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