步骤：
1各种物品的准备与高温蒸汽灭菌
2 菌种的培养:LB液体培养基24h
3离心
4有些方法如滤纸保藏法、液氮保藏法和冷冻干燥保藏法等均需使用保护剂来制备细胞悬液，以防止因冷冻或水分不断升华对细胞的损害。

保护性溶质可通过氢和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。

保护剂有牛乳、血清、糖类、甘油、二甲亚砜等。

5真空冷冻干燥。

大肠杆菌的冷冻真空干燥法
【试剂与器材】1．菌种: 保存的大肠杆菌
2．培养基：LB液体培养基
3．溶液或试剂:脱脂奶粉
4．仪器或其他用具1ml枪头、无菌滴管，冻干管（青霉素瓶），普通冰箱，低温冰箱(-30℃)、离心机、离心管、锥形瓶、试管、灭菌锅、烘干箱等。

【操作步骤】
1．准备冻干管：青霉素瓶（5ml）用蒸馏水冲洗1～2次，加四层纱布封口后，121℃灭菌30min备用。

配制保护剂：将脱脂奶粉配成10%乳液, 115℃，灭菌10min,随机抽样进行无菌检查,确认无菌后方可使用。

2．培养菌种：将要保存的菌种接入LB斜面培养基中，36±1℃培养24h后，镜检后转接LB液体培养基36±1℃培养24h。

3．离心（细胞收集）：将长好菌的液体培养基分装灭过菌的离心管，6000r/min离心10min。

4. 加保护液：每100ml 培养基离心出的细胞加入5-10ml 保护液混匀。

5、分装样品：用灭过菌的1ml枪头吸取加过菌的保护剂，注入到冻干管中（2mL）。

6．预冻：将加好保护剂的冻干管盖上胶盖封上纱布放于饭盒中，置于-30℃冰柜冷冻24h-48h 即可。

7．冷冻真空干燥: 启动冷冻真空干燥机制冷系统。

当温度下降到-50℃以下时，将冻结好的样品在无菌条件下打开胶盖（不拿下来，留一个缝隙即可）封好纱布，迅速放入冻干机钟罩内，启动真空泵抽气直至样品干燥（约24h）。

8．取出样品：先关真空泵、再关制冷机，打开进气阀使钟罩内真空度逐渐下降，直至与室内气压相等后打开钟罩，取出样品。

先取几只冻干管在桌面上轻敲几下，样品很快疏散．说明干燥程度达到要求。

若用力颠，样品不与内壁脱开，也不松散，则需继续冷冻真空干燥，此时样品不需事先预冻。

9. 熔封用高频电火花真空检测仪检测冻干管内的真空程度。

当检测仪将要触及冻干管时，发出蓝色电光说明管内的真空度很好，便在火焰下(氧气与煤气混合调节，或用酒精喷灯)熔封冻干管。

（青霉素瓶不用这步）
10. 检测存活性每个菌株取1支冻干管及时进行存活检测。

打开冻干管，加入0.2m1无菌水，用毛细滴管吹打几次，沉淀物溶解后(丝状真菌、酵母菌则需要置室温平衡30 min～60min)，转入适宜的培养基培养，根据生长状况确定其存活性，或用平板计数法或死活染色方法确定存活率,如需要可测定其特性。

11．保存置4℃或室温保存(前者为宜)。

隔时进行检测。

12．取用冻干管时，先用75％乙醇将冻干管外壁擦干净，再用砂轮或锉刀在冻干管上端画
一小痕迹，然后将所画之处向外，两手握住冻干管的上下两端,稍向外用力便可打开冻干管，或将冻干管近口烧热，在热处滴几滴水，使之破裂，再用镊子敲开。

【注意事项】样品干燥的程度对菌种保存的时间影响很大。

一般要求样品的含水量为1%～3%，判断方法：外观样品表面出现裂痕，与冻干管内壁有脱落现象，对照管完全干燥；指示剂用30g/L的氯化钴水溶液分装冻干管，当溶液的颜色由红变浅蓝后，再抽同样长的时间即可。

将微生物冷冻，在减压下利用升华作用除去水分，使细胞的生理活动趋于停止，从而长期维持存活状态。

操作步骤如下：
好氧菌冷冻干燥管的制备
• 1 安瓿管准备
安瓿管材料以中性玻璃为宜。

清洗安瓿管时，先用2%盐酸浸泡过夜，自来水冲洗干净后，用蒸馏水浸泡至pH中性，干燥后、贴上标签，标上菌号及时间，加入脱脂棉塞后，121℃下高压灭菌15-20分钟，备用。

• 2 保护剂的选择和准备
保护剂种类要根据微生物类别选择。

配制保护剂时，应注意其浓度及pH值，以及灭菌方法。

如血清，可用过滤灭菌；
牛奶要先脱脂，用离心方法去除上层油脂，一般在100℃间歇煮沸2-3次，每次10-30分钟，备用。

• 3 冻干样品的准备
在最适宜的培养条件下将细胞培养至静止期或成熟期，进行纯度检查后（参见科技部自然科技资源平台联合管理办公室文件《微生物菌种纯度检测技术规程》（试行）），与保护剂混合均匀，分装。

微生物培养物浓度以细胞或孢子不少于108-1010个/ml为宜（以大肠杆菌为例，为了取得每毫升1010个活细胞菌液2毫升-2.5毫升，只需10毫升琼脂斜面两支）。

采用较长的毛细滴管，直接滴入安瓿管底部，注意不要溅污上部管壁，每管分装量约0.1-0.2毫升，若是球形安瓿管，装量为半个球部。

若是液体培养的微生物，应离心去除培养基，然后将培养物与保护剂混匀，再分装于安瓿管中。

分装安瓿管时间尽量要短，最好在1-2小时内分装完毕并预冻。

分装时应注意在无菌条件下操作。

• 4 预冻一般预冻2小时以上，温度达到-20℃到-35℃左右。

• 5 冷冻干燥采用冷冻干燥机进行冷冻干燥。

将冷冻后的样品安瓿管置于冷冻干燥机的干燥箱内，开始冷冻干燥，时间一般为8-20小时。

• 6 真空封口及真空检验将安瓿管颈部用强火焰拉细，然后采用真空泵抽真空，在真空条件下将安瓿管颈部加热熔封。

熔封后的干燥管可采用高频电火花真空测定仪测定真空度。

•7 保藏安瓿管应低温避光保藏。

•8 质量检查冷冻干燥后抽取若干支安瓿管进行各项指标检查，如存活率、生产能力、形态变异、杂菌污染等。

•厌氧菌冷冻干燥管的制备
•主要程序与需氧菌操作相同，注意保护剂的选择和准备，保护剂使用前应在100℃的沸水中煮沸15分钟左右，脱气后放入冷水中急冷，除掉保护剂中的溶解氧。

•复苏方法
•——先用70%酒精棉花擦拭安瓿上部，将安瓿管顶部烧热，用无菌棉签沾冷水，在顶部擦一圈，顶部出现裂纹，用挫刀或镊子颈部轻叩一下，敲下已开裂的安瓿管的顶端，用无菌水或培养液溶解菌块，使用无菌吸管移入新鲜培养基上，进行适温培养。