一．菌种的保存
重组DNA 分子(质粒、噬菌体、粘性质粒)必须导入宿主菌中，通过细菌培养来扩增所需的重组DNA。

通常采用宿主菌是大肠杆菌，根据不同载体需求，选用不同品系大肠杆菌
1. 概述：大肠杆菌其它微生物一样，都具有稳定遗传性和变异性、遗传性，保证微生物本身特征的相对稳定，即无性繁殖过程中能够保持原有的性状，为菌种保藏提供了有利因此，而变异性，使微生物的性状在繁殖过程中出现某些改变，给菌种保藏带来了困难。

由于存在变异，即菌种常出现所谓的退化，主要指理想性状的丧失，从而导致发育缓慢，存活率和产质量降低等现象，菌种保藏工作就是使菌种的变异降低至最小水平，使菌种在较长期的保藏之后仍然保持着原有的生命力、优良生产性能、形态特征以及不污染杂菌。

能够长期在研究上应用。

2. 微生物的变异速度，通常情况下，与其新陈代谢速度有关，微生物代谢活力旺盛，它的变异速度快，代谢活动微弱，变异速度就慢。

并且在多次的无性繁殖过程中可能会有突变的积累。

人们利用这一规律，可以创造各种条件，使微生物活动处于微弱活动或不活动状态，以减少变异的发生。

3. 菌种保藏的原理是：通过低温、干燥、隔绝空气和断绝营养等手段，以达最大限度地降低菌种的代谢强度，抑制细菌的生长和繁殖。

由于菌种的代谢相对静止，生命活动将处休眠状态，从而可以保藏较长时间。

要求保存的菌种在复苏后除保持以前的生活与繁殖能力、不发生形态特征、生理状态及遗传性状的
改变外，还不允许污染任何杂菌。

此外，在保存前应确保菌种的单纯性，先分离单菌落后进行鉴定，然后再繁殖保存。

4. 常用的长期保存法有：液体石蜡法、硅胶保存法、加入甘油或二甲基亚砜（DMSD）等保护剂。

5. 甘油低温保存法(－70℃—－196℃)的特点
i.
甘油菌低温保存的基本原理是：在-70℃或液氮中冻存，细菌内的酶活性均己停止，即代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。

在0℃—-70℃温度范围内，水晶呈针状，极易招致细菌的严重损伤。

用电镜观察，可见细菌的核膜上有大量针尖样小孔。

因此，为了避免0℃—-70℃冰晶的形成和细菌膜两侧离子平衡的破坏，需要加保护剂。

甘油可降低冰点，在缓慢的冻结条件下，能使细菌内水分在冻结前透出细菌外。

贮存在-70℃以下低温中能减少冰晶形成，甘油对细菌无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细菌.
ii.
使用浓度范围为15%-50%，一般常用30%。

在保存瓶中按1：1加入60%的甘油和菌液，混匀后贮存于-70℃或液氮中。

复苏后细菌仍能生长，活力不受任何影响。

二、菌种的复苏
复苏菌种时，用接种环或牙签挑取少许冻结的菌种到平皿上，37℃培养8-12小时即可。

甘油菌从冰箱取出使用时应置于低温或0℃冰浴中，用完尽快放回，接种时挑取表面已融化部分即可，不可全溶，因反复冻融会导致细胞壁破裂。

切记：接种过程中不得使保存瓶中的菌液融化。

三、大肠杆菌培养
1.培养基配制：培养基从形态上分为液体与固体培养基。

根据有无抗生素和其他选择性药物分为普通与选择培养基，常用LB培养基。

1）LB（Luria-Bertain)液体培养基配制
精解蛋白胨(bacto-tryptone)1.0%
酵母浸出粉(bacto-extract)0.5%
氯化钠1.0%
搅拌使之完全溶解，用5molNaOH(about0.2ml/1000ml培养基）调pH至7.0，如用进口试剂可不
必调，高压灭菌20min(120℃0.1Mpa)
2）含琼脂的固体培养基配制
（1）普通培养基:固体培养基是在液体培养基中加1.5%琼脂制成，先配液体培养基，然后加入1.5%琼脂，高压灭菌20min，取出后再无菌状态下铺平板
（2）选择性培养基:将消毒好的固体培养基置室温下冷却50℃时加抗生素或其他必加成分，摇匀后倒入灭菌皿中厚度2-3mm, 室温固化。

(抗生素用三蒸水溶解后，用无菌滤头过滤到无菌瓶中, 氨苄青霉素终浓度50μl/ml)新制备的固体培养基较湿，铺上的液体不易吸收，可在室温下放2-3天，或37℃放半小时，然后4℃保存备用。

（3）LB培养基中所用抗生素终浓度：氨苄青霉素-50μl/ml；氯霉素-20μl/ml；庆大霉素
-15μl/ml；卡那霉素-30μl/ml；春日霉素-1000μl/ml；壮观霉素-100μl/ml；链霉素-30μl/ml；四环素-12μl/ml。

注意：除了四环素保存-20℃，其余均应保存4℃，所有抗生素均应溶于无菌去离子水。

四环素对光敏感
2.液体细菌培养
1）小量培养:
(1) 取灭菌16 或18mm 口径培养管，加3-5mlLB 培养基，再加50mg/ml 氨苄青霉素3-5ul（宿主菌不加抗生素）
(2) 无菌牙签挑取单菌落，送入培养液中，或取菌液5-10ul，转入培养液中，封好管口
(3) 37℃摇床培养100-200r/min 至生长饱和，约6-12 小时
2）大量培养:取500ml 培养瓶内装培养基100-200ml，及相应抗生素。

以0.5-1%浓度接种菌液，37 度摇床培养100-200r/min至OD值0.6-0.8。

3.固体细菌培养: 用于单一菌落的挑选，转化后抗性菌落的筛选。

方法：采用划痕接种法。

用接种环从菌种中沾取少量菌液，划线。