限制性内切酶的选择：
1、酶切产生的末端是否能和载体直接相连？ 2、酶的作用是否被DNA碱基修饰作用所抑制？ 3、酶解的时间影响最后产生的目的片段的大小？
载体的选择
根据基因组的大小来选建的，利用了噬菌体的包装效率高和杂交筛选背景低的优 点；另一类经改造的质粒载体或人工染色体，其主要优点 在于可容纳超过 100kb 以上的外源片段。
原始序列可能缺失的原rbon 于 1975 年提出如下的计算公式：
N=ln（1-p）/ln段的大） 基因组的构建（Genomic DNA ）
载体（Vectors）的代表性 代表性是指中所有克隆所携带的 DNA 片段重新糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳）
3）克隆特定的mRNA
为了克隆
方法：
1. Fractionate on the gel （利用mRNA的大小不同，从凝胶中回收）
2. Subtracted cDDNA
TTTTTP-5’
The first and second strands synthesis
5）cDNA末端的处理
大片段的平末端连接效率很低，所以必需对双链cDNA的末端进行加工， 可以通过添加接头（linkers）进行改造。
The process :
切除突出的 3’-ends (单链特异性核酸酶)
CCG/AATTCGG-3’ TTTTTGGCTTAA/GCC-OH
EcoR I 消化
5’-pAATTCGGGGGG 3’-GCCCCCC
CCG-3’ TTTTTGGCTTAAp-5’
Ligate to vector and transform
end preparation and linker addition to duplex cDNA
补平3’-ends (DNA聚合酶的klenow 片段和 dNTPs)
连接双链cDNA的平末端和接头 (T4 DNA ligase) 接头中可以嵌入酶切位点(EcoR I )
酶切产生粘性末端 (EcoR I )
5’-pGGGG 3’-CCCCCCC
5’-pGGGG 3’-CCC
Duplex cDNA
No cDNA library was made from prokaryotic mRNA!
• 原
Gene libraries anon、purification
=1.1 ×103
ln(1-0.99)
Nhuman = ln[1-(2 ×104/3 ×109c DNA
(纯化基因组DNA)
Eukaryotes 真核生物 Prokaryotes 原核生物
Break DNA into fragments randomly
dCTP
mRNA
AAAAACC-3’
cDNA
TTTTTP-5’
Alkali (hydrolyaes RNA)
Purify DNA oligo(dG)
cDNA
TTTTTP-5’
Klenow polymerase or reverse
Transcriptase 、4dNTPs
5’-pGGGG 3’-CCCCCCC
Hybridize the labeled probe with DNA membrane (Southern) or RNA (Northern) membrane （加入探针，在膜上进行杂交）
I3 Screening procedures
2） 菌落及噬菌斑杂交
Transfer the DNA in the plaque or colony to a Nylon or nitrocellulose membrane
X-ray film(radioactively labeled )
Wash to remove unhybridization probe and visualize
antibody or
enzyme (抗体或酶）
Line up the hybridizated region or repeated hybridization (标出被杂交区域，重复杂交)
6）连接载体
任何一个载体都可与带有EcoRI 酶切位点的 外源片段连接！
The process :
载体去磷酸化（避免自连）
连接载体和cDNA片段（ T4 DNA ligase）
(plasmid or λ--筛选 2） Colony and plaque hybridization
Hybridization to identify the interested DNA
or its RNA product
Radiolabeled probes （放射性标记的探针）
Blotting the DNA or RNA on a membrane （将目的DNA或RNA吸附在膜上）
cDNA libraries 5’
5’ 3’
5’ 3’-CCCCCCC
primer 5’-pGGGG-OH 3’-CCCCCCC
mRNA
AAAAA-3’
Reverse transcriptase HO-TTTTTP-5’
4 dNTPs
primer
mRNA
AAAAA-3’
cDNA
Terminal
TTTTTP-5’ transferries and screening
Genries： 来自某种生物的不同 DNA序列的总集，这些DNA序列已经被克 隆在载体上，以便于纯化、贮存和分析。
Fo入的片段大小为 20 kb ，计算 Ecoli(4.6×106 b=
ln( 1-0.99) ln[1-(2×104/4.6×106)]
Bacterial colonies must be lysed to
Phage DNA bind to
release DNA on the membrane
the membrane directly
surface.
（噬菌斑）
(菌落，碱裂解)
Hybridization (in a solution
Containing Nucleic acid probe)（与探针杂交）
-3’ TTTTTp-5’
单链特异性核酸酶
-3’
TTTTTp-5’ Klenow 聚合酶、dNTP
用 EcoR I 甲基化酶处理
5’-pGGGG 3’-CCCC
加入嵌入酶切位点的 接头进行连接
-3’ TTTTTp-5’
HO-CCG/AATTCGG-3’ 3’-GGCTTAA/GCC-OH
接头
HO-CCG/AATTCGGGGGG 3’-GGCTTAA/GCCCCCC
4）合成cDNA
cDNA第一链的合成（First stand synthesis） reverse transcriptase(反转录酶) 、 pr（4种）
cDNA第二链的合成（Second strand synthesis） 对第一链的3’端“加尾”， 再用与之互补的引物 合成第二链，保证获得全长cDNA。
Probe with 32p-labled DNA complementary to gene of interest
Expose to film
Screening by plaque hybridization
Gene libraries (根据来源不同)
Genommic DNA)
cDN- copy of mRNA)
1、Geno gene libraries ）
Vectors Plasmid insert (kb) 5
phageλ cosmid YAC
23
45 1000
常用的基因组克隆载体 λ relacement vectors（替换型）BAC 的构建流程图2、cDNA
cDNA对于真核生物的基因分析非常有用！1）cDNA从mRNA逆转录而来，代表了基因中的可转录部分（去除 了非转录序列） 2）cDNAs 不含有内含子 （intron sequences ），可以直接在大 肠杆菌中表达 3）可以用于鉴定新基因 4）不同类型的细胞和组织表达特定的基因（奢侈基因）
(随机切割DNA)
Clone these fragments into vectors
（将片段克隆入载体）
纯化基因组DNA：
真核生物——细胞分级分离法： 破裂细胞，去除蛋白质、脂类、次生代谢物、其他生物 大分子
原核生物：直接抽提
随机切割DNA：
物理剪切：吹打、震荡、超声波 限制性内切酶切割：部分酶切可产生较大片段的DNA
Screening procedures
Transfer to nitrocellulose or nylon membrane
Keep master Select positive
plate
from master plate
Denature DNA(NaOH) Bake onto membrane
mRNA的提取、纯化
Check the RNA integrity
检测mRNA的完整性
Fractionate and enrich mRNA
mRNA的分级分离、富集
Synthesis of cDNA
合成cDNA
Treatment of cDNA ends
cDNA的末端处理
Ligation to vector 与载体连接
--菌落及噬菌斑杂交
3） Expression screening—表达筛选 4） Hybrid arrest and release—杂交扣留与释放 5）Chromosome walking (repeat
sc
2）检查mRNA的完整性
Make sure that the mRNA is not degraded. （确定mRNA没有被降解）