cell的标记基因表达 ✓ 筛选>2000个化合物 ✓ 药物直接加入水中
筛选结果
➢ 检测neural crest cell的标记基因表 达量
➢ 药物处理后，表 达量1-5分级定量
➢ 3是表达量没有变 化，1是表达消失， 5是表达增加
➢ 定量<2，被认为 有效药物，占整 个化合物库的3%

clinically meaningful doses

斑马鱼药物筛选实例二：心脏病
• 致心律失常性心肌病 (ACM)，是青年人猝死的 一种重要病因

early fibrosis
• 常染色体显性遗传
• > 10 genes
• Incidence： 1/1000 – 1/10000
斑马鱼的生物学特性与药物筛选

• 体型小（3-5厘米、养殖密度10条/L） • 易于养殖（低成本、高样品数量） • 四季产卵、产卵量大（>200枚/条雌鱼，实验方便）
Rennekamp&Peterson et al., Currently Opin Chem Biol, 2015
斑马鱼是炎症和损伤修复的理想模型

➢ 斑马鱼是研究损伤修复、组织再生的理想模型
心脏病
白血病
化学遗传学
筛选策略与设计
化合物/药物毒性
神经系统功能
癌症
血管发生
脊椎动物发育过程
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
每类筛选工作的数量（次）
化合物浓度选择

Rennekamp&Peterson et al., Currently Opin Chem Biol, 2015
adipocytes infiltration
• 已知细胞桥粒基因的变异， 引发心肌细胞病变，是 ACM的重要原因
• plakoglobin (g-catenin) is one of them

斑马鱼ACM模型

• Transgenic fish expressing human plakoglobin (2057del2) • Abnormal cardiac physiology within 48 hours of fertilization • A fully penetrant cardiomyopathy with in 4-6 weeks • Die earlier

• 发现新药 • 发现已有药物的替代药物（强效、副作用、特异性）
• 发现已有药物的新作用 • 发现影响生物学过程的新化合物 • 了解已有药物的作用机理，探索疾病成因 • 探索化合物之间的相互作用
应用斑马鱼进行化合物筛选

• First screen: Harvard University, Department of Molecular and Cellular Biology, 2000
✓ Screen what？
✓ Small molecules
✓ Size of the library?
✓ 1,100 synthetic small molecules
✓ What phenotype?
✓ early development ✓ fertilized zebrafish eggs ✓ Wild type ✓ 96-well plates ✓ 3 embryos per well (per compoud) ✓ Molecules were added to H2O

应用斑马鱼进行化合物筛选
• 始于2000年 • 到2015年，共有66篇发表的工作 • 至今有超过100篇的工作

Rennekamp&Peterson et al., Currently Opin Chem Biol, 2015
化合物筛选的目的
➢ Neutrophils must be removed from the site by either apoptosis or reverse migration
➢ Disable to do neutrophil clearance may rise persistent inflammation
• chamber dilatation
Asimaki et al., Science Translational Medicine, 2014
斑马鱼ACM模型

✓ Decreased heart rate ✓ Decreased stroke volume ✓ Decreased cardiac output
in second test • 3 compounds confirmed • Best candidate: SB216763
Asimaki et al., Science Translational Medicine, 2014

SB216763缓解大鼠心肌细胞症状

斑马鱼：新兴的药物筛选工具
潘鲁湲 国家斑马鱼资源中心 luyuanpan@
2019年5月10日
讲座内容
一、斑马鱼药物筛选概况 ➢ 药物筛选实验概述 ➢ 斑马鱼的生物学特性与化合物筛选 ➢ 斑马鱼药物筛选的基本流程与系统
二、斑马鱼药物筛选实例解析 ➢ 癌症药物筛选实例 ➢ 心血管病药物筛选实例 ➢ 中药相关筛选
斑马鱼的生物学特性与药物筛选

• 体型小（3-5厘米、养殖密度10条/L） • 易于养殖（低成本、高样品数量） • 四季产卵、产卵量大（>200枚/条雌鱼，实验方便）
Rennekamp&Peterson et al., Currently Opin Chem Biol, 2015

• 71%的人类基因在斑马鱼基因组中有同源基因 • 69%的斑马鱼基因在人类基因组中有同源基因 • OMIM数据库中，人类疾病相关基因82%都可以在斑马鱼基因组中找到
同源基因
涉及人类疾病的各个领域

代谢类疾病
纤毛类疾病
感染免疫
糖尿病
组织再生

Asimaki et al., Science Translational Medicine, 2014
斑马鱼药物筛选实例三：中药相关

➢ 3篇斑马鱼药物筛选工作和中药成分有关 ➢ 2篇与丹参有关（血管再生/炎症与创伤修复） ➢ 1篇与中药当归龙荟丸有关（白血病）
二、斑马鱼药物筛选实例解析 ➢ 癌症药物筛选实例 ➢ 心血管病药物筛选实例 ➢ 中药相关筛选

斑马鱼药物筛选实例一：癌症

• 黑色素瘤：黑色素细胞恶变，可发于皮肤、粘膜、 内脏
• 皮肤癌的高致死原因
• 已知oncogene，BRAF，是人类黑色素瘤中最常见 突变
[stroke volume × heart rate (nl/min)]
Asimaki et al., Science Translational Medicine, 2014
筛选减轻ACM症状的药物
• 4200 small molecules • 25 larvae per compound • 50 hits first round • >50 larvae per compound
✓ Animal age? ✓ Animal genotypes? ✓ Size of screening system? ✓ Sample size of animal? ✓ How to apply chemicals?
Peterson et al., PNAS,2000
斑马鱼的生物学特性

斑马鱼的生物学特性与药物筛选

• 体型小（3-5厘米、养殖密度10条/L） • 易于养殖（低成本、高样品数量） • 四季产卵、产卵量大（>200枚/条雌鱼，实验方便）
Rennekamp&Peterson et al., Currently Opin Chem Biol, 2015
• 黑色素细胞，最早是由embryonic neural crest发 育而来
斑马鱼药物筛选实例一：癌症

• 黑色素瘤：黑色素细胞恶变，可发于皮肤、粘膜、 内脏
• 皮肤癌的高致死原因
• 已知oncogene，BRAF，是人类黑色素瘤中最常见 突变
• 黑色素细胞，最早是由embryonic neural crest发 育而来
稀释 - 分装 - 加样 - 洗脱
高通量筛选需要的系统

高通量检测系统 - 动物存活率/发
育程度检测 - 行为学检测
高通量筛选需要的系统

高通量检测系统 - 动物存活率/发
育程度检测 - 行为学检测 - 荧光标记检测
讲座内容
一、斑马鱼药物筛选概况 ➢ 药物筛选实验概述 ➢ 斑马鱼的生物学特性与化合物筛选 ➢ 斑马鱼药物筛选的基本流程与系统
斑马鱼的生物学特性
• 发育快（24hr早期发育结束、3个月性成熟） • 体外受精、体外发育（易于实现很多实验操作） • 胚胎透明（易于操作与活体观察）

Rennekamp&Peterson et al., Currently Opin Chem Biol, 2015
斑马鱼的生物学特性:与人类同源性高
• 已知某些抑制neural crest发育的因素，也可以抑 制黑色素瘤的生长
斑马鱼黑色素瘤模型
White et al., Nature, 2011

✓ 引入人类致病突变： BRAF（V600E)
✓ 在幼鱼和成鱼中引 发黑色素瘤表型
✓ 以此模型进行药物 筛选
✓ 作用于斑马鱼胚胎 ✓ 检测neural crest
➢ After damage, inflammation and resolution of it are required for the elimination of infection and repair of damaged tissue