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斑马鱼在药物评价中的应用
3.心血管毒性评价：心脏是斑马鱼第一个发育起来并发挥 作用的器官,也是很多化合物的首要作用靶点。由于胚胎 和幼鱼的透明性,无需借助遥测或其他技术就可以实时观 察心跳、心脏的收缩性、血液循环,非常的便利。 4.肝脏毒性评价：药物引起的肝损伤是制药业一个主要的 毒理学问题。目前,应用斑马鱼进行的肝脏毒性评价终点 主要有血清酶、肝细胞凋亡、细胞色素P450和组织病 理学变化。
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3.结果：雷公藤甲素、苦参碱和大黄素对于斑马 鱼的LC50值依次为5.02 x10-3、113.2和1.18 x103 ug /mL, 毒性大小顺序与文献报道基本一 致。
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斑马鱼的ห้องสมุดไป่ตู้脏再生 Heart Regeneration in Zebrafish
• 斑马鱼的Mps1 mitotic checkpoint kinase是 一个至关重要的细胞周期调节因子，如发 生突变，则斑马鱼的心脏不能被修复而形 成疤痕。因此，损伤诱导的斑马鱼心肌细 胞增殖可以克服疤痕形成，使心肌再生。 这个发现表明斑马鱼在分析心脏再生的分 子机制方面起重要作用。
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2.方法：实验前一天禁食。取成体斑马鱼分别臵 于含有30~ 50mL溶液的瓶中, 保持瓶中溶液温 度恒定在25℃，随机分为空白对照, 溶剂对照及 各药物浓度给药组, 每组含15条。分别给予纯净 水, 含不同浓度药物的纯净水。
记录不同浓度药液中斑马鱼在24h内的死亡数量 (只), 计算死亡率(% )。根据实验结果, 采用Bliss 法计算LC50值。
实验模式动物—斑马鱼
Use Zebrafish AS A Model Organism
生药学 张彩
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汇报内容
• 斑马鱼概况
• 斑马鱼作为模式生物的优点 • 斑马鱼在药物的评价中的应用 • 采用模式生物斑马鱼评价三种中药成分的急性 毒性
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第一部分
概
况
• 70年代早期，斑马鱼仅在一个研究中心被 详细研究：在位于Eugene 的 俄勒冈大学， Charles Kimmel 及其同事开始将斑马鱼作为 研究发育的动物模型，并探索其作用。
5 days
2.5 days
6 days
3 days
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斑马鱼的骨骼发育
缺少chordin表达的斑 马鱼的BMP蛋白水平 异常，鳍和尾部骨架 也异常—注射chordin mRNA后可恢复。因 此研究者使用斑马鱼 的这项特性来进行基 因筛查，以确定脊椎 动物骨骼形成的调节 机制。
—Rik Derynck Nature Genetics ,1999
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心脏切除后心室肌的再生
Regeneration of ventricular myocardium in the resected zebrafish heart
13 DECEMBER 2002 VOL 298 SCIENCE
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斑马鱼在药物评价中的应用
1.一般毒性评价 2.发育毒性评价 3.心血管毒性评价 4.肝脏毒性评价 5.神经毒性评价 6.肾毒性评价 7.肠胃毒性评价 8.视觉毒性评价 9.耳毒性评价 10.软骨毒性评价
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斑马鱼在药物评价中的应用
7.胃肠毒性评价：斑马鱼的胃肠系统和人体胃肠系统有着 千差万别,斑马鱼没有胃,肠道直接开始于咽部下的一小 段食道之后。在发育的早期肠道就开始蠕动,在未喂食时 就自发的游走性蠕动,由于幼鱼是透明的,这些蠕动清晰 可见。 8. 视觉毒性评价：斑马鱼有着与人类相似的锥形视网膜,有 色彩视觉,这点超越了喜好夜间活动的啮齿类模式生物。 同时,斑马鱼胚胎期视觉系统发育迅速,幼鱼就展示了视 觉介导的行为,故可用于评价化合物对视觉的影响。
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斑马鱼在药物评价中的应用
1.一般毒性评价：在化合物的一般毒性评价可在胚胎、幼 鱼、成鱼的各个阶段进行,相应的观察指标略有不同。在 胚胎期,在化合物的作用下可观察终点有卵凝结、体节形 成、尾部延展、心跳、色素沉着、孵化率、畸形率等。 幼鱼和成鱼主要是统计LC50、死亡率等。 2.发育毒性评价：在胚胎发育和幼鱼发育过程中,很多器官 系统的形成过程对药物的介人是相当敏感的,比如脑、心 血管、肝脏、软骨、脊索、胰腺、肠道、肾脏,极易导致 畸形的产生,是评价药物致畸性的有效模型之一。
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斑马鱼在药物评价中的应用
9.耳毒性评价：斑马鱼侧线上的神经丘在结构和功能上就 相当于人内耳的毛细胞。神经丘在侧线上从头至尾排列, 胚胎时期在光镜下清楚可见,有助于药物作用下,观察其 形态和功能变化。 10.软骨毒性评价：斑马鱼的骨头与人类的相似,颅面骨骼 都有膜内和软骨内成骨。斑马鱼也有成骨细胞核和骨细 胞,并布满血管,受神经支配。
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心血管系统发育 Development of Zebrafish Vascular System
Nature Medicine, 1995
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Development of Zebrafish Vascular System
28 hours 3.5 days
1.5 days
4.5 days
2 days
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斑马鱼的繁殖
♀
♂
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斑马鱼胚胎早期发育图谱
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斑马鱼作为模式生物的优点
1.斑马鱼基因与人类基因的相似度达到87%，这意味着在其身 上做药物实验所得到的结果在多数情况下也适用于人体，因 此它受到生物学家的重视。
2.斑马鱼的胚胎是透明的，所以生物学家很容易观察到药物对其 体内器官的影响。 3.此外，雌性斑马鱼可产卵数百枚，胚胎在24小时内就可发育 成形，这使得生物学家可以在同一代鱼身上进行不同的实验， 进而研究病理演化过程并找到病因。
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斑马鱼在药物评价中的应用
5.神经毒性评价：斑马鱼胚胎在24hpf原代神经元细胞开始 分化,48hpf脑室形成,在6dPf所有的神经系统形成,斑马 鱼可在短时间呈现整个神经系统,可作为一个有机载体, 建立一个快速的、有效的评价药物神经毒性的平台。 6.肾毒性评价：斑马鱼的原肾由一对肾单位、两个肾小球 和前肾小管组成,较为简单。庆大霉素可引起哺乳动物肾 中毒,其表型在斑马鱼原肾上也可看到,既肾小球滤过率 降低。尽管结构的复杂程度不一样,但是在肾损伤表型方 面却是保守的。所以以斑马鱼为肾毒性评价载体,能为药 物在临床上的应用提供重要的参考价值。
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采用模式生物斑马鱼评价三种中药成分的急性毒 性
1.主要试剂：雷公藤甲素( tripto lide) , 中国医学 科学院协和医科大学皮肤病研究所(江苏, 南京) 惠赠,纯度大于98% . 大黄素( emod in) , 瑞雷植 化制剂厂提供, 含量98%. 苦参碱( matrine), 江 苏天晟药业有限公司产品, 含量98%. DMSO 为 S igma公司产品(美国)。超纯水取自M illipore 超纯水机。
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斑马鱼基本特性
• 产于热带印度，孟加拉国。 • 成鱼体长4～6厘米。体呈纺锤形。雌雄易 区分。 • 性情温和，对水温水质要求不高，易饲养。 • 属卵生鱼类 ，4月龄进入性成熟期。繁殖期 约7天左右。产卵量高，繁殖力很强 。 • 体外受精，胚胎透明，在24小时内就可发 育成形， 2~3天孵出仔鱼 。
Chuck Kimmel
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斑马鱼作为模式动物逐渐受到关注 Turn Eyes to Fish
• Christiane Nü sslein-Volhard
Wolfgang Driever
• 1995 诺贝尔奖获得者
was able to identify and classify a small number of genes that are of key importance in determining the body plan and the formation of body segments, turned eyes to fish and find a wide range of mutations