（5） 结晶新方法
Nucleant 生物玻璃
晶体初步鉴定
偏光显微镜观察、染色、电泳等
3、衍射数据收集和处理
第三代同步辐射光源的应用使得用20-40 um大小的晶体解析高分辨率结构已经成为 现实 目前世界上比较著名的同步辐射工作站有 多个：APS（USA）; ESRF（France）; SPring-8（Japan）
第五章 蛋白质结构解析
测定蛋白质结构的意义
• 人体基因数目仅比低等生物线虫多两倍。 如此少的基因是如何创造出人体如此复杂 的生命活动？ • 人体基因的主要功能是通过蛋白质来实现 的，蛋白质扮演着构筑生命大厦的主要角 色。人体中大约有10万种蛋白质。
蛋白质三维结构解析方法
X-射线晶体衍射法：85.3% 核磁共振波谱：14.7%
X射线本质
X射线是一种短波长(0.005～10nm)、 高能量(2.5×105 ～1.2×102eV)的电磁波。 它是原子内层电子在高速运动电子流冲 击下，产生跃迁而发射的电磁辐射。
A
一般由高速电子撞击金属产生。如图所示，是一种产生X 射线的真空管，K是发射电子的热阴极，A是由钼、钨或 铜等金属制成的阳极。两极之间加有数万伏特的高电压， 使电子流加速，向阳极A撞击而产生X射线。
图片出处: http://www.drg.de/data/wuerdig ungen/Nobelpreise/RoenNobel .htm
图片出处: /arc hive/gal/source/kendrew.html
肌红蛋白的三维结构模型
图片出处: http:// / archive/Kendrew62.html
同步辐射光源
上海同步辐射中心
晶体收集和储存
液氮气冷技术
4、位相求解
1. 分子置换法(MR) 2. 多对同晶型置换法(MIR) 3. 多波长反常散射法(MAD) 实验中经常联合使用
分子置换法(MR)
分子置换法就是把已知结构的蛋白质分子 放到待测蛋白质晶体的晶胞中建立起初始 结构模型并借助此模型计算待测蛋白质晶 体各个衍射点的相角的方法。
通过在待测结晶蛋白质溶液的体积、浓度 和组成固定的条件下，直接将不同量的饱 和沉淀剂加入未饱和的蛋白质溶液以产生 一个浓度梯度而使蛋白质在不同的过饱和 溶液中结晶。
（2）透析法( Dialysis )
利用半透膜允许小分子透过而大分子不能 透过的性质来调节蛋白质溶液的沉淀剂浓 度、pH或离子强度，从而使蛋白质溶液缓 慢形成过饱和状态以形成晶核。该法是培 养蛋白质晶体的常用方法。
血红蛋白的四级结构 模型
图片出处/structure/proteinstructure10.asp
血红蛋白分子就是由二个由141个氨基酸残基组成的α亚基和二个由146个氨基酸 残基组成的β亚基按特定的接触和排列组成的一个球状蛋白质分子，每个亚基中 各有一个含亚铁离子的血红素辅基。四个亚基间靠氢键和八个盐键维系着血红蛋 白分子严密的空间构象。
肌红蛋白的三维结构
图片出处: /Article/UploadFil es/200411121548876.jpg
1959年佩鲁茨 (Perute)完成血 红蛋白0.55分辨 率的晶体结构
图片出处:/webinfo/jiaoyanzujianshe/hua xue/zhuye/minrentang/1962.htm (1962)
由于测定出蛋白质的精细结构,两位英国科 学家M.F.佩鲁茨和J.C.肯德鲁获得1962年的诺 贝尔化学奖。
图片出处：/nobel/micro/46132.html
1997年,核小体八组蛋白结构
2004年,菠菜捕光复合物LHC-II
2005年，线粒体膜蛋白复合物2精细结构
X射线衍射测定蛋白和核酸精细结构，为新药设计提供了全新方向
中国科学家研制抗癌新药首获瑞典爱明诺夫奖
施一公抗癌抗乙肝病毒新药Birinapant，进入临床二期
蛋白质X射线晶体结构测定程序
1、样品制备 2、蛋白质结晶和晶体生长
3、衍射数据收集和处理
4、位相求解 5、模型建立和修正
核磁共振可以方便地在溶液中研究分子结构并且是唯一 可以使试样不经受任何破坏的结构分析方法。 目前核磁共振成象技术已能以活人为观察对象，扫描身 体中任何器官或组织的任何一个断面的核磁共振参数，成 为一种引人注目的癌症早期诊断技术。
核磁共振技术（NMR）
1 9 4 6 年 美 国 斯 坦 福 大 学 的 F.Bloch 和 哈 佛 大 学 的 E.M.Purcell两个研究小组首次独立观察到核磁共振现象， 为此他们两人获1952年诺贝尔物理奖。 1983 年，瑞士科学家 Kurt Wü thrich 教授实验室首次运用 核磁共振方法解析了胰高血糖素（glucagon）多肽的溶液构 象. 发明了利用核磁共振 (NMR) 技术测定溶液中生物大分子三维 结构的方法获得了2002年度诺贝尔化学奖 74岁的美国科学家保罗· 劳特布尔和70岁的英国科学家彼 得· 曼斯菲尔德为2003诺贝尔医学奖的得主
蛋白质结晶方法
（1）批量结晶法（Batch crystallization） （2）透析法( Dialysis ) （3） 液相扩散法(Liquid diffusion) （4） 气相扩散法（Vapour diffusion） （5） 蛋白质结晶新方法
（1）批量结晶法（Batch crystallization）
威廉· 康拉德· 伦琴 Wilhelm Conrad Rö ntgen
1901年第一届诺贝尔物理学奖评选时， 29封推荐信中就有17封集中推荐他。伦 琴最终获得了第一次诺贝尔物理学奖金
诺贝尔物理奖奖章
图片出处/gxxyd/sjet/jingdian/nobel/medal01.htm
一个重原子衍生物作为母体，用一个晶体
就可以收集到重原子反常散射吸收边两侧
的多套数据，并解出结构。
5、模型建立和修正
晶体学R因子一般要求达到0.2以下
键长偏差大约为0.015Å
键角偏差约为3°
二面角构象分布要求除了甘氨酸的二面角 构象是随机的外，其他残基的二面角构象 分布受到立体化学的限制
（3） 液相扩散法(Liquid diffusion)
利用液相平衡原理而设计的。由于蛋白质在 不同溶液中的溶解度不同，把待结晶蛋白质 溶液缓慢加入溶解性差异大的溶剂中，在界
面处形成沉淀剂浓度梯度在局部达到瞬间过
饱和，从而促使晶核形成。
（4） 气相扩散法（Vapour diffusion）
把待结晶蛋白质、高于此蛋白质结晶所需盐 浓度的溶液和低于这种浓度的盐溶液放在一 个密闭体系内，两种浓度不同的溶液由于发 生蒸汽扩散最后达到平衡，随着溶液中沉淀 剂浓度的增加蛋白质溶解性降低，从而蛋白 质达到过饱和而析出晶体。
亨利· 布拉格(Henry Bragg) 劳伦斯· 布拉格( Lawrence Bragg)
图片出处http://202.202.4.150/nobel/nobel1.htm
图片出处
/physics/laureates/1915/wl-braggbio.html
伦琴实验室
图片出处: /viewthread.php?tid=4758
人类第一张X光照片
伦琴妻子之手
图片出处:/yxxt/jindai/xgjsy/xgjsy.htm
1896年1月23日伦 琴将这一重大发现在维 尔兹堡物理医学会上报 告。Kolliker教授提议 将该射线命名为“伦琴 射线”,但伦琴却说： “我还没有彻底解释这 种射线的发生现象，还 是称它为X射线最恰 当。”
X-射线晶体结构分析基本原理
X射线衍射分析所依赖的基本原理是X射线衍射现象 X射线衍射现象利用X射线的波长和晶体中原子的大小及
原子间距同数量级的特性来分析晶体结构。
当X射线入射到样品晶体分子上时，分子上的每个原子使 X射线发生散射，这些散射波之间相互叠加形成衍射图形。 衍射图形能给出样品内部结构的许多资料，如原子间的 距离、键角，分子的立体结构、绝对构型、原子和分子
X射线衍射
1912年Max von Laue发现X射线具有衍 射的现象。（1914年的诺贝尔物理学奖）
图片出处:
/nobel/netshow/nobelscience/phys ics/physics03.htm
劳厄的实验装置
图片出处:/wuli/optics/ch2/page/ch51.htm
电镜三维重构、各种光谱技术、显微
技术和计算机模拟
蛋白质三维结构解析过程
第一节 X-射线衍射测定蛋白质结构
1895年11月8日 ,德国物 理学家，50岁的伦琴在 自己的实验室中偶然发 现 一种从阴极射线管 中辐射出的新型射线， 由于对管子发出的“东 西”性质不确定，伦琴 就把这种射线命名为 “X射线” 。
的堆积、有序或无序的排列等。
X射线通过红宝石晶体(a)和硅单晶体(b)所拍摄的劳厄斑
图片出处:/wuli/optics/ch2/page/ch51.htm
因在用X射线研究晶体结构方面所作出的杰出贡 献 ,亨利· 布拉格（William Henry Bragg）和劳伦 斯· 布拉格（William Lawrence Bragg）父子分享了 1915年的诺贝尔物理学奖。
多对同晶型置换法(MIR)
在蛋白质晶体中引入散射能力强的重金属 原子如Pb和Hg等作为标志原子，制备出重 原子的衍生物，然后求出这些重原子在晶 胞中的坐标，根据坐标计算出重原子散射 波在各个衍射点的相角，最后推测出蛋白 质分子在各个衍射中的位相。
多波长反常散射法(MAD)
利用同步辐射波长连续可变的特点，使用
X-Ray晶体衍射目前仍然是蛋白质三维结构测定的 主要方法 优点：分辨率高，能精确确定生物大分子中各原子 的坐标、键长、键角,给出生物大分子的分子结构和 构型,确定活性中心的位置和结构 缺点：只能测定单晶，反映静态结构信息，无法测 定溶液中的信息