1 pBait-AbAi载体的构建（酵母报道子的构建）注：酵母报道子（pBait-AbAi）包含目的顺式作用元件的一个或多个拷贝，且插入到pAbAi载体AbAi r报告基因的上游。

大量研究表明最有效的构建应包含目的DNA三个以上的首尾连接的拷贝。

首尾连接的拷贝产生方式很多，但对于长度小于20 bp的调控元件，人工合成寡核苷酸是最方便可靠的途径。

（1）设计并合成包含目的序列的两条反向平行的寡核苷酸序列，且两端加上与pAbAi载体酶切产物一致的粘性末端（建议合成一个目的序列的突变序列作为对照，以排除可能的假阳性）。

（2）用TE buffer溶解寡核苷酸至终浓度100 μmol/L。

（3）将正向链和反向链按照1:1的比例混合（退火后的双链寡核苷酸最大浓度为50 μmol/L）。

（4）95 ︒C保温30 s，去除二级结构。

（5）72 ︒C保温2 min，37 ︒C保温2 min，25 ︒C保温2min。

注：缓慢退火，有助于双链寡核苷酸的形成。

（6）冰上放置。

退火后的产物可贮存在-20 ︒C冰箱备用。

（7）酶切1 μL pAbAi载体，用凝胶回收纯化或柱纯化的方式纯化酶切产物。

注：回收前，可用琼脂糖凝胶检测是否酶切完全。

（8）将退火后的寡核苷酸稀释100倍至终浓度为0.5 μmol/L。

（9）在连接反应管中加入如下成分：pAbAi载体（50 ng/μL） 1.0 μLannealed oligonucleotide （0.5 μmol/L） 1.0 μL10×T4 DNA ligase buffer 1.5 μLBSA（10 mg/mL）0.5 μLNuclease-free H2O 10.5 μLT4 DNA ligase （400 U/μL）0.5 μL总体积15 μL注：如果有必要，可用1 μL nuclease-free H2O代替寡核苷酸作为阴性对照。

（10）将反应体系室温放置连接3 h，转化E coli，采用常规方法检测阳性克隆。

注：可用酶切或测序进行检测。

2 质粒转化酵母细胞，生成Bait-Reporter酵母菌株（图）图3 Bait-Reporter酵母菌株生成原理示意图（1）用BstB I或者Bbs I酶切2 μL pBait-AbAi，pMutant-AbAi，p53-AbAi质粒，使其在URA3基因处断开，纯化酶切产物。

（2）按Matchmaker Yeast Transformation System 2的步骤用1 μl酶切后的质粒转化Y1HGold酵母。

（3）稀释每个转化体系至1/10、1/100、1/1000，分别取每个稀释物均匀涂于SD/-Ura琼脂平板上。

3 d后挑取5个单克隆，用Matchmaker Insert Check PCR Mix1进行PCR检测阳性克隆，用Y1HGold的单克隆做阴性对照。

（4）在PCR管中加25 μl PCR-grade H2O。

（5）用干净的枪头轻轻接触酵母单克隆，以获得非常少量的酵母细胞。

将枪头伸进PCR-grade H2O中搅拌，使酵母细胞散开。

注：切忌挑取整个酵母单克隆，因为细胞过多会阻止PCR反应的进行。

如果加入细胞后水变浑浊，证明加入了过多的酵母细胞。

（6）向每个管中加入25 μl Matchmaker Insert Check PCR Mix，混匀，离心。

每个PCR管中现已含有如下反应物：Matchmaker Insert Check PCR Mix 25 μlH2O/yeast 25 μl总体积50 μl（7）按下述程序进行PCR反应；95 ︒C 1 min98 ︒C 10 s55 ︒C 30 s 30 cycles68 ︒C 2 min（8）取5 μl PCR产物，用1%的琼脂糖凝胶电泳分析。

注：引物与AbA基因以及URA3下游的Y1HGold基因组结合，扩增片段长约1.4 kb。

图4 PCR检测pBait-AbAi的插入情况正确的PCR检测结果应是：阳性对照：1.4 kb阴性对照：无条带诱饵菌株：1.35 kb+insert size（9）分别挑取PCR检测呈阳性的诱饵克隆和p53-AbAi对照克隆，在SD/-Ura 平板上划线培养。

30 ︒C孵育3 d后，将平板置于4 ︒C保存，即为新构建的Y1HGold[Bait/AbAi]菌株和[p53/AbAi]对照菌株。

（10）经过长期放置后，挑取单克隆在YPDA液体培养基中过夜培养，离心收集菌体，用 1 mL预冷培养基（100 ml灭菌的YPDA与50 ml灭菌的75%甘油混合）重悬菌体，速冻后与-70 ︒C保存。

3 检测诱饵菌株AbA r基因的表达在不存在捕获物的情况下，由于克隆到pAbAi载体中的诱饵序列不同，诱饵菌株报告基因的本底表达水平也不相同。

例如：p53-AbAi对照的最低aureobasidin A抑制浓度为100 ng/ml。

注：酵母单杂交实验成功的前提是没有内源转录因子能够与目的序列结合或者结合能力非常弱。

因此在进行文库筛选之前，检测所构建的诱饵菌株AbA r基因的表达情况十分重要。

所以需要进行实验以确定进行文库筛选时抑制诱饵菌株报告基因本底表达所需的AbA浓度。

（1）分别挑取诱饵克隆和对照克隆，用0.9% NaCl重悬细胞，调节A600到0.002（大约2000个细胞/100 μl）。

（2）在下述培养基上分别涂布100 μl重悬后的菌液，30 ︒C培养2-3 d。

SD/-UraSD/-Ura with AbA （100 ng/mL）SD/-Ura with AbA （150 ng/mL）SD/-Ura with AbA （200 ng/mL）预期结果如下所示：表1 AbA r基因预期本底表达结果[AbA]/（ng/mL）Y1HGold[p53-AbAi]克隆数Y1HGold[pBait-AbAi]克隆数0 约2000 约2000100 0 Bait dependent150 0 Bait dependent200 0 Bait dependent（3）在进行文库筛选时，使用AbA的浓度应为最低抑制浓度，或使用比最低抑制浓度稍高的AbA浓度（高约50-100 ng/mL），以彻底抑制诱饵菌株的生长。

注：如果200 ng/mL AbA不能抑制本底表达，可以尝试提高AbA浓度至500-1000 ng/mL。

然而，在不存在捕获物的情况下，如果1000 ng/mL的AbA浓度仍无法抑制AbA r基因的表达，那么很可能存在能够识别并与目的序列结合的内源调控因子，因而该目的序列无法用来进行酵母单杂交筛选。

4 文库cDNA的合成提取试材总RNA，进行反转录合成cDNA。

合成的cDNA末端具有与pGADT7-Rec相同的酶切位点。

（1）cDNA第一链的合成①准备高质量的poly A和/或总RNA，用human placenta poly A+RNA作为阳性对照。

注：RNA的质量决定文库的质量，RNA应为所要研究的特定时期和特定组织的RNA。

②在微量离心管中加入如下反应物：RNA模板（0.025-1.0 μg poly A和/或0.10-2.0 μg总RNA）1-2 μl CDS III（oligo-dT）or CDS III/6（random）引物 1.0 μl Deionized H2O （使总体积达到4.0 μl）1-2 μl 总体积 4.0 μl在另外一支管中加入对照cDNA反应物，即RNA使用1 μl（1 μg）control poly A+RNA。

③72 ︒C孵育2 min。

④冰上放置2 min，轻轻混匀，立即加入步骤⑤中的试剂。

⑤每一个反应加入如下试剂，轻轻混匀离心。

5×first-strand buffer 2.0 μlDTT（100 mmol/L） 1.0 μldNTP mixture（10 mmol/L） 1.0 μlSMART M-MLV RT 1.0 μl总体积 5.0 μl注：步骤⑤中的试剂可在步骤②之前加好置于冰上。

此步是cDNA合成的起始关键步骤，变性后的RNA/引物mix冰上放置的时间不应超过2 min。

⑥如果用的是CDS III/6随机引物，25-30 ︒C保温10 min。

如果用的是CDS III 引物，省略此步，进行步骤⑦。

⑦42 ︒C保温10 min。

⑧加入1 μl SMART III oligo，充分混合，42 ︒C保温1 h。

⑨75 ︒C保温10 min终止第一链的合成。

⑩降至室温，加入1 μl RNase H（2 U）。

11 37 ︒C保温20 min。

12 cDNA第一链合成产物应于-20 ︒C保存，可用3个月。

（2）long distance PCR （LD-PCR）合成cDNA 第二链根据合成cDNA第一链时使用的RNA量，下表给出了进行LD-PCR时最佳的热循环数。

使用的热循环数越少，非特异性PCR产物越少。

表2 RNA量与最佳热循环数总RNA/μg Poly A+RNA/μg 循环数1.0-2.0 0.5-1.0 15-200.5-1.0 0.25-0.5 20-220.25-0.5 0.125-0.25 22-240.05-0.25 0.025-0.125 24-26⑴LD-PCR反应混合物中加入如下物质（每个样品做2个100 μl体系，对照做1个100 μl体系）：First-strand cDNA （from protocol A） 2 μlDeionized H2O 70 μl10×advantage 2 PCR buffer 10 μl50×dNTP mix 2 μl5’RACE引物 2 μl3’RACE引物 2 μlMelting solution 10 μl50×advantage 2 polymerase mix 2 μl总体积100 μl⑵按照以下程序进行PCR反应：1个循环95 ︒C 30 sX个循环95 ︒C 10 s68 ︒C 6 min1个循环68 ︒C 5 min⑶取7 μl PCR产物用1.2%的琼脂糖凝胶检测，检测时使用1 kb DNA ladder。

（2）使用CHROMA SPIN+TE-400柱纯化ds cDNA⑴为每一个要纯化的cDNA样品准备一个CHROMA SPIN+TE-400柱。

⑵将纯化柱翻转几次，充分悬浮gel matrix。

⑶移去柱的顶盖和底盖，将柱放入2 ml收集管中。

⑷将柱放入离心机，700 g离心5 min以消除平衡缓冲液，弃掉收集管中的液体。

⑸将柱放入新的收集管中，把cDNA加到gel matrix的中央，切勿使样品沿柱的内壁流下。

注：加到边上易使样品沿柱内壁流下，易混有小片段cDNA。