酵母单杂交序列，而无需分离、 纯化蛋白。 酵母单杂交体系检测到的与DNA结合的蛋 白质是处于自然构象，克服了体外研究时 蛋白质通常处于非自然构象的缺点，因而 具有很高的灵敏性。
将共转化的酵母菌株涂布于选择培养基上，筛选 表达相互作用的杂种蛋白（激活报告基因转录） 的阳性菌落。
酵母双杂交的原理
AD BD
UAS
GAL-LACZADຫໍສະໝຸດ Prey-ADBait-BD
BD
UAS
GAL-LACZ
双杂交系统的组成示意图
酵母杂交出现假阳性的原因：
1. 可能与酵母中其他蛋白质的作用有关； 2. 在某些酵母菌株中大量表达外源蛋白质 常会带来毒性作用，从而影响菌株生长及 报告基因的表型； 3. 为了抑制背景表达而在培养基中添加的 3-AT（3-Aminotriazole，氨基三唑，一种 除草剂)或6-Azauracil（氮尿嘧啶）也对菌 株有一定毒性，使一些蛋白质间较弱的相 互作用可能会因此而被掩盖 。
2、反转录生成cDNA: 反转录酶，oligo(dT) ,R6 3、与噬菌体载体分子连接 4、噬菌体的包装
mRNA
逆转录酶
cDNA
复制
双链cDNA
载体
重组DNA分子
有特殊碱基序 列的单链DNA 或RNA分子,可 以用放射性物 质或免疫性物 质标记,通过 杂交,DNA探针 常用于检测互 补的碱基序列。
酵母双杂交系统的局限性
该系统要求Bait蛋白能够被稳定地表达成融 合蛋白，且该融合蛋白必须能被转运到细 胞核内，因而不能被转运到细胞核内的蛋 白质如细胞浆蛋白、细胞膜蛋白的相互作 用的研究就不宜用该系统; 如果某些哺乳动物细胞蛋白质是经过翻译 后加工才能相互作用，则该系统也不适用， 因为酵母的后加工系统与哺乳动物细胞后 加工系统不尽相同.
双杂交系统组成部分:
选择缺失GAL4编码基因的酵母寄主菌株
表达诱饵蛋白的载体，诱饵即是我们感兴趣的蛋 白，它和DNA结合结构域融合. 表达靶蛋白的载体，靶蛋白即是我们要寻找的可 以与诱饵相互作用的蛋白，靶蛋白活结构域融合. 一个或多个报告基因(lacz his3 leu)
三杂交系统
两个蛋 白之间 通过第 三者发 生相互 作用
TF:介导蛋白质相互作用的第三种因子. 可以是蛋白质,DNA,RNA或小分子配体
适 用 范 围
蛋白质三杂交系统
a 蛋白Z稳定了蛋白A和B之间的作用; b 蛋白质A和B通过蛋白Z相互作用; c 蛋白Z改变了A的结构，使得B能与之作用
酵母单杂交
3. 酵母双(单)杂交的 原理及应用
3.1 酵母双杂交体系 （Yeast tow-hybrid system）
基于对真核生物调控转录起始过程的认识，高灵敏度
的研究蛋白质之间关系的技术。。 细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。 反式转录激活因子GAL4：结构包括两部分： DNA结合功能域(DNA binding domain,DNA-BD) 转录激活结构域（activation domain，DNA-AD） 被分开的两者通过适当的途径在空间上较为接 近时，才能重新呈现完整的GAL4转录因子活性，并可激 活上游激活序列（upstream activating sequence, UAS）的下游启动子，使下游基因得到转录。
酵母单杂交体系是1993年由Wang和Reed创立的
酵母单杂交体系是借鉴酵母双杂交体系的 基本原理，通过观察酵母细胞内报告基因 的表达状况，研究DNA一蛋白质之间的相 互作用。
酵母单杂交系统组成 (1)将基因片段与GAL4转录激活域融合报告基因的报告质 粒. （3）三缺型酵母受体：Leu- ，His-，Ura （Leu，His及尿嘧啶合成缺陷型 ）
Fused peptide
Gal-AD
cyc1
lacz 薛红卫 2004
基本流程:
构建含靶结合序列的报告载体 转化，以证实DNA一蛋白质结合 活性 进一步分析:
酵母单杂交技术的应用
(1)确定已知DNA一蛋白质之间是否存在相互 作用; (2)分离编码结合于目的顺式调控元件或其他 短DNA结合位点蛋白的新基因; (3)定位已经证实的具有相互作用的DNA结合 蛋白的DNA结合结构域以及准确定位与 DNA结合的核苷酸序列。 （4）正向与反向单杂交体系的结合还可用于 筛选阻碍DNA与蛋白质相互作用的突变的 单个核苷酸
分子生物学技术1. cDNA cDNA(complementary DNA library)以 组织细胞中的mRNA为模板，反转录合成双 链cDNA ，各cDNA分子分别插入载体形成 重组子，再导入宿主细胞克隆扩增。这mRNA制备：纯化试剂盒，生物 素
酵母双杂交系统的应用：
发现新蛋白和蛋白的新功能 研究抗原和抗体的作用（细胞内） 检测已知蛋白质之间的相互作用 确定末知蛋白之间的相互作用 确定基因治疗中多肽类药物的作用机理
酵母双杂交系统的优点
用体内实验来研究蛋白质的相互作用，方法精确， 不受外界影响，易于操作; 所有操作均在核酸水平进行，无需纯化大量的蛋 白质，可以精确测定蛋白质的弱相互作用； 运用范围较大：酵母双杂交系统中的诱饵蛋白可 以是完整的蛋白质，也可以是蛋白质的一个功能 区，可以大到一个完整的肿瘤抑制蛋白，也可以 小到一个约22个氨基酸的多肽。A cDNA AD融合表达A BB 双重报道子
筛选cDNA AD融合表达的示意图Construction of library Gal-AD Fused peptide
Introduce bait vector into yeast
Gal cis
cyc1 lacz
Library screening