柠檬酸测定综述摘要：柠檬酸作为一大有机酸，广泛应用于有关行业，为此对于其量的测定至关重要。
例如在食品中，柠檬酸作为添加剂，其含量是检测食品质量的一项重要指标。
本综述简述了柠檬酸测定的方法，如高效液相色谱法、反相高效液相色谱法、离子色谱法、气相色谱法、毛细管电泳法等。
关键词：柠檬酸；测定方法；高效液相色谱法；反相高效液相色谱法；离子色谱法；气相色谱法1．前言柠檬酸是一种广泛存在于动植物组织和各种水果、蔬菜中的有机酸，与人类的健康密切相关，可增强人体的正常代谢[1]。
由于其物理性能、化学性能、衍生物的性能,被广泛应用于一些食品加工领域。
如用于各种饮料、汽水、葡萄酒、糖果、饼干、罐头果汁、乳制品等食品的制造 [2]。
在食品上，柠檬酸的含量对其味道的影响很大，并且在某些食品的品质指标测定的一大指标。
但是柠檬酸的使用范围是受到严格限制的[2]，不能无限制的添加。
为此，如何定性和定量的测定柠檬酸的含量有重要的意义。
目前，测定柠檬酸的方法有高效液相色谱法[3]、反相高效液相色谱法[4]、离子色谱法[5]、气相色谱法[6]、微分电位溶出法[7]、毛细管电泳法[8]、动力学法[9]、酶法[10]等。
现将各种测定方法在柠檬酸测定中的使用逐一介绍。
2．分析方法2．1 高效液相色谱法（HPLC）高效液相色谱法是目前应用最多的色谱分析方法,高效液相色谱系统由流动相储液体瓶、输液泵、进样器、色谱柱、检测器和记录器组成. 与经典液相色谱相比有以下优点:速度快、分辨率高、灵敏度高、色谱柱可反复使用、样品量少且易回收等。
利用高效液相色谱法测定柠檬酸有以下优点：能够直接进行检测，避免杂质等的影响；测定方法简便，时间短，结果准确。
特别是对于芳香族有机酸和多元酸,已被广泛用于各种食品和天然物中有机酸的测定[2]。
王永军等[3]在利用HPLC 检测方法时，建立了一种准确对发酵液中柠檬酸含量测定的仪器方法,在检测范围6～16mg/ mL 之间呈线性, R = 0. 999 7 , RSD 为±0. 8 %～1. 2 %( n = 6) ,最低检测浓度为0. 02mg/mL。
这种方法简单、灵敏、重现性好，避免了由于化学转化所引起的测定误差，以及发酵液中色素的影响。
对于采用HPLC法测定柠檬酸的方法，在文献中有很多。
刘加兰等[11]用Atlantis C18(5μm，4．6×150mm)色谱柱，以0．05 mol／L Na2HPO4(pH 2．8)溶液做流动相，流速0．8mL／min，紫外检测波长210 nm，一次性分离柠檬酸发酵液中的草酸、苹果酸、a一酮戊二酸、柠檬酸、富马酸、乌头酸、柠康酸。
建立了七种有机酸成分的回归方程，各有机酸回收率大于97％，相对标准偏差(RSD)0．27％一3．24％。
唐慧慧和蔡清宇等[12]以O.8% NH4H2PO4水溶液为流动相，采用色谱柱Reliasil C18(4.6×250mm,5μm),Agilent 1100 series液相色谱系统；四元泵G1311A；柱温箱G1316A；检测器VWDG1314A Agilent Chemstation色谱工作站的方法，建立了净乌梅及乌梅炭饮片中柠檬酸、苹果酸的测定。
另外，王剑飞等人[13]采用甲醇-0.02mol/L磷酸二氢钾（5:95）为流动相，流速为0.7ml/min，SPD-M20A型二极管阵列检测器，色谱柱：lnertsilODS-SP4．6x150mm：预柱：Shim-packGODS，分析5中葡萄酒中柠檬酸的含量，结果显示均符合要求。
谭志静[14]采用Hibarcolumn RT 色谱柱,以磷酸盐缓冲溶液(p H = 2. 5)为流动相,在检测波长为214nm 的条件下测定了葡萄果肉和葡萄皮中有机酸(柠檬酸、苹果酸等) 含量。
贺永鸿等[15]选用Kromasil NH2色谱柱,流动相为5 % 的乙酸水溶液,检测波长为250nm ,测定白糖中的柠檬酸。
而陈琳[16]等为了检测乌梅丸中柠檬酸的含量采用的方法类似于王剑飞的方法，不同之处在于流动相的流速设定在0.5mL/min，检测波长为214nm。
HPLC 灵敏度非常高,但是样品的预处理操作繁琐,再加上测定周期长、实验成本高、测定完后需要清除残留样品,若能与其它技术联用,缩短检测周期、降低实验成本,该方法在检测有机酸方面会有更大的进展[2]。
2. 2 反相高效液相色谱（RP-HPLC）反相高效液相色谱，是目前应用范围很广的色谱分析方法，其分离方法和检测方式有多种，在检测时根据样品构成与性质来选择所需的色谱条件，如色谱柱等。
一些常见的ODS 色谱柱如Hypersil 、Eclip se Zorbax XDB、SinoChrom、Nucleosil 等均可以用于食品中柠檬酸的分析测定[2]。
柠檬酸在水中很容易发生电离,产生多峰现象. 为了使其尽可能地以分子形式存在,一般使用酸性流动相来抑制柠檬酸的离解. 通常在流动相中加入磷酸盐缓冲液、冰醋酸、磷酸等[17]。
在有机酸色谱分析中，甲醇-磷酸盐溶液系统与甲醇-硫酸溶液系统是反相C18柱中最常用的两种流动相[18]。
相较而言，前者能更好的控制整个体系的pH，为此一般在实验中采用该种溶液作为流动相。
RP-HPLC法目前在食品检测中发挥了重要的作用，能同时测定多种有机酸。
莫海涛等[4]就利用该法测定发酵饮料中的有机酸和维生素C的量，用DiamonsilC18柱，3%CH3OH-0.05ml/LNa2HPO4（pH2.50）缓冲液作为流动相，流速设定在1.00mL/min，柱温为30℃，检测波长为215nm，在这种条件下能很好的分离和测定常见的10种有机酸和Vc量。
方法相对标准偏差0.048%-4.416%，回收率为98.6%-101.9%各成分的线性相关系数r﹥0.99。
在色谱法中通常采用可变波长紫外检测器检测，以保留时间为定性分析的依据；但是对于部分的有机酸，其保留的时间很短，如草酸，与色谱系统的死时间相近，因此在样品分析过程中很易被样品中的不易保留成分所干扰，造成误差。
故莫海涛等[4]采用二极管阵列检测器检测，能实时快速200-400nm的紫外-可见吸收光谱，通过采集到的样品成分的光谱与标准成分光谱对照并结合保留时间和Waters Millenium32色谱工作站的峰纯度检测功能，能较好的克服紫外检测器定性较为粗糙的缺点。
庞新安等[19]利用SinoChrom ODS—BP分析柱(4．6mm×250mm，5 u m，大连依利特科学仪器有限公司)；流速：1．0ml／min；柱温：37℃；检测波长：210nm；进样量：20 u 1；流动相：磷酸氢二铵缓冲溶液，浓度0．01mol／L，pH=2．88，测定新疆地产四种特色果品种中5种有机酸含量，峰面积和有机酸浓度的线性相关系数均在0.999以上。
而杨毅等[20]应用反相C l8色谱柱Nucleosil 100C l8250×4．0mm，以0．1mol／L KH2PO4(用H3PO4调pH3．0)为流动相，紫外检测215 nm，将啤酒中草酸、丙酮酸、苹果酸、a一酮戊二酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、富马酸、琥珀酸一次性分离。
反相色谱的固定相表面的添加物会与样品中的物质发生反应,造成柱子污染,从而导致色谱行为发生变化,使测定的结果不准确。
因此,使用该方法之前首先要保证所测样品中的物质不会与柱子中的添加物发生反应[2]。
2.3 离子色谱法（IC）离子色谱法作为一种分析有机酸的有效方法，按照分离原理可分为离子交换色谱（IEC）和离子排斥色谱（ICE）2种。
IEC 的原理是树脂上可电离离子与流动相中具有相同电荷的离子及被测组分的离子进行可逆交换,根据各离子与离子交换基团具有不同的电荷吸引力而分离。
该色谱法主要用于分析有机酸、氨基酸、多肽及核酸[2]。
在分离低分子有机酸方面,无须对样品进行复杂的预处理,能够很好地分离和同时检测多种有机酸物质[21]。
目前，应用IC法检测柠檬酸的分析研究有很多的报道。
对于IEC法，谢海国等[22]采用DX-80 Ion Analyzer色谱仪：Ionpac AG14A-5μm(3mm×30mm product No.056899)为保护柱，Ionpac AG14A-5μm(3mm×30mm P/N 053891-21)为分析柱，在28μs左右的背景电导、流速0.5ml/min下，以10μl体积进样，测定尿液中草酸及柠檬酸的含量。
对ICE法，李路华等[23]采用：Shim—Pack SCR-102H 离子排斥色谱柱，8．0 mm i．d．×30 cm，7μm；流动相：2 mmol／L盐酸水溶液，pH 值3．3，流速0．5 mI ／min；柱温45℃；纸速2 mm／min测定酸奶中的有机酸（柠檬酸、丙二酸、DL-苹果酸、乳酸、戊二酸、乙酸）。
有关离子色谱法的研究还有很多，如吴玉萍等[24]采用美国Dionex 公司DX-500 型离子色谱仪，用H2O、5mmol/LNaOH梯度淋洗，流速为1.5ml/min,测定了烟草中的苹果酸、柠檬酸、NO3-、NO2-等成分。
胡维胜等[25]采用Metrosep OrganicAcids有机酸柱(250mm×7．8mm×10μm)，Metrosep RP Guard保护柱，温度为20℃，背景电导控制在50μs／cm左右；淋洗液选用0．3mmol／L硫酸和15％丙酮的混合溶液，流速0．3 ml／min；再生液为10mmol／L LiC1；进样量20μl，分析麦汁和啤酒体系中有机酸的含量。
虽然IC 已广泛应用于食品中有机酸的测定,但是离子色谱由于淋洗液和柱填料的特殊性,对样品中蛋白质含量有严格限定,不适合做复杂的样品分析,而且柱子的容量小,进样量不宜太多。
因此,对于含有复杂成分的食品,不适合用此方法检测柠檬酸的含量[2]。
2.4 气相色谱法（GC ）气相色谱法，是根据试样中各物质物理性质的不同,在气相和固定液液相间分配系数的不同，汽化后的试样被载气“载入”色谱柱分析，组分在两相间进行分配，由于固定相的吸附（或溶解）能力因组份不同有所差异，从而达到分离的目的。
气相色谱与不同检测器联用，可以大大提高检测灵敏度，例如气相—质谱（GC —MS ）就是一种具有高分离、高灵敏度、分析速度和鉴定能力的分离技术，现在很多分析研究都采用该法。
杜曦等[26]利用衍生化气相色谱法分离测定葡萄、葡萄酒中多元有机酸；通过不同酯化方法的比较，选择在N ，N 一二甲基甲酰胺非质子溶剂中，利用碘乙烷与多元有机酸的四甲基铵盐反应制备各酸相应的乙酯，在SE 一30色谱柱上利用程序升温进行分离，同时采用内标法鉴定分析了葡萄、葡萄酒中的多种多元有机酸，并比较测定了葡萄和葡萄酒中多元有机酸的含量。