灵芝多糖抗肿瘤靶向作用机制研究进展【关键词】灵芝多糖抗肿瘤靶向灵芝在中国已有2000多年的药用历史，大量的民间实践证明灵芝对多种疾病具有明显的疗效，其主要药效成分为(ganoderma lucidum polysaccharides， GLP)， GLP存在于灵芝属真菌的菌丝体和子实体中，由肽多糖、葡聚糖、杂多糖等组成的混合物，是灵芝的主要有效成分之一，尤其GLP 药理活性广泛; 具有提高机体免疫功能、抗肿瘤等作用。

1 GLP抗肿瘤的药理研究现状1.1 GLP物质的化学成分《中国药典》2000年版首次收录了灵芝（包括赤芝、紫芝）。

GLP的化学成分主要从赤灵芝（Ganoderma lucidum Karst）的子实体中分离得到一种具有促进T淋巴细胞分裂的多糖，相对分子质量（Mr）为718 000，不含蛋白质，是一种自由D-葡萄糖组成的具有β-（1-6）残基侧链的β-（1→3）-D葡萄糖，与其他多糖相比其分歧程度较低，具有三股螺旋结构，认为其活性与其三股螺旋结构、离子基团及负电荷的密度有关。

从赤芝中分离得到一个水溶性抗肿瘤多糖GL-1，由葡萄糖、木糖=阿拉伯糖组成，该多糖具有抗S180肿瘤细胞的作用，还分离得到抗衰老多糖GLA、GLB、 GLC等［1］; Saito等从灵芝子实体碱性提取物中分得的GLP，由D-葡萄糖、 D-半乳糖、 D-甘露糖、 D-木糖L-岩藻糖、 L-鼠李糖、 L阿拉伯糖等组成; GLP的化学结构、空间构象有明确细致的显示。

黎铁立等从泰山赤芝（ganoderma lucidum karst）中分离得到7个多糖肽，其中二个为TGLP-2和TGLP-3。

TGLP-2的Mr为2.09×105，为β-（1→3）（1→4）苷键连接的甘露葡聚糖肽，含肽量为8.9%。

TGLP-3的Mr为405 000，为β-（1→3）（1→4）（1→6）苷键连接的葡聚糖肽，且有α-苷键存在，含肽量为4%。

1.2 GLP的抗肿瘤机制自20世纪70年代以来，国内外研究学者均重视灵芝的抗肿瘤作用。

Miyazaki等从灵芝子实体中分离出一种Mr为40 000的水溶性多糖（GL-1），其单糖组成及为葡萄糖: 木糖、阿拉伯糖，小鼠腹腔注射共10 d，发现有抑制 S-180肉瘤的作用。

李旭生等从灵芝子实体中提取的GLP肽对C3H小鼠的恶性肿瘤有抑制作用，抑制率为55.5%。

林志彬等［2］采用血清药理学实验方法和分子生物学技术，将GLP进行昆明小鼠灌胃亦可显著抑制BALB/c皮下移植的S-180肉瘤生长，其抑制率为52.86%。

可见， GLP对动物移植性肿瘤具有抑制作用，可使瘤重减轻，生存时间延长。

灵芝所含多糖是其抗肿瘤作用的重要组成部分。

Wang等报告中灵芝子实体提取的一种GLP能抑制HL-60细胞增殖并促进其凋亡。

但张群毫等［3］发现灵芝提取物对S-180细胞的增殖无直接抑制作用。

同样，将灵芝提取物的GLP直接加入到培养液中，对HL-60细胞的生长也无直接抑制作用。

林志彬也发现灵芝提取物不能直接诱导S-180细胞凋亡。

以上结果表明，灵芝其所含多糖既不能直接抑制或杀死肿瘤细胞，也不能诱导肿瘤细胞凋亡。

为进一步探讨GLP的抗肿瘤作用机制，将GLPB加入到小鼠腹腔巨噬细胞培养液中，共同培养24 h，然后加入HL-60细胞中，可显著抑制HL-60细胞增殖并促进其凋亡［2］。

这一结果显示，在GLPB作用下， GLP中出现一种能抑制HL-60细胞增殖并促进其凋亡的活性物质。

与此同时，上清液中TNF-α的分泌亦明显增加。

这些结果与Wang等所研究的结果是一致的，他们在HL-60细胞和V937细胞培养液中加入PS-G与人外周血单个核细胞共同培养液则可显著抑制HL-60细胞和V937细胞增殖，并促进其凋亡; 同时还证明，在健康人外周血单个核细胞或T淋巴细胞培养液中加入PS-G的共同培养上清液可明显促进巨噬细胞生成IL-1β、 TNF和IL-6，并促进T淋巴细胞生成IFN-γ等。

GLP并不是直接杀死肿瘤细胞，而是通过介导加强宿主免疫功能而激活机体内各种免疫应答，进而产生抑制肿瘤细胞作用。

但GLP的抗癌构效关系和抗癌机制仍不明了，现有的研究表明，GLP大多是β-(1→3)-D-葡聚糖.β-葡聚糖中分支度不同，均具有较高的抗癌活性， Mr大的也较Mr小的活性强; 由于GLPMr 大，不能透过半透膜，不能直接进入靶细胞，对细胞没有明显的抑制效果。

新近的一些研究发现，含有其他结构的GLP和某些小分子量的也具有免疫调节和抗癌活性。

2 GLP分子质量与纳米活性载体的机制2.1 肿瘤靶向的结构基础病理条件下，肿瘤细胞生长或转移时，病变细胞释放的化学物质和肿瘤衍生的甲状旁腺激素相关肽(parathyroid hormone-related peptide， PTHrP)均通过产生NO和激活KATP来降低集合淋巴管“节律泵”的活性，从而影响了淋巴的生成、转运［4］。

这提示我们，病理条件下，淋巴回流入血速率减小，药物靶向于肿瘤的淋巴系统有利于延长驻留时间，提高药效。

毛细淋巴管由单层内皮细胞构成，其基底膜不完整或缺乏，因而通透性大，存在着淋巴引流的通道，大小约30~120 nm，在癌细胞生长时可进一步扩大为300~500 nm。

这一通道允许大分子或大小适合的胶束随着扩散而被淋巴引流带入，并在流经淋巴结时被巨噬细胞捕获; 纳米活性载体是通过这样的过程实现淋巴肿瘤靶向的。

2.2 GLP纳米活性载体的作用 GLP纳米活性载体具有淋巴趋向性，毛细淋巴管内皮细胞间有1 203 nm的开放间隙，但管壁没有周细胞，也没有连续的基膜。

纳米微粒在药剂学中的尺寸界定在10~1 000 nm，这样的纳米微粒可被巨噬细胞摄取。

这些细胞多存在于血流丰富的肝脏、肺脏、脾脏及淋巴结、肠、骨髓、脑、结缔组织和浆膜腔等［5］。

将大MrGLP改造成纳米微粒具有高的结构稳定性、较为清晰的核壳相分离，疏水链段之间由于疏水相互作用而聚集形成微粒的内核，外壳则由亲水链段形成刷状结构。

这样亲水链段通常具有生物相容性并对纳米微粒分散在水中起立体稳定作用，在亲水链段末端还可引入具有靶向功能的组分［6］。

当GLP纳米微粒用于给药载体时，其特点是内核载药量大，在人体内分布主要由颗粒大小和颗粒表面活性剂相比， GLP纳米微粒的临界胶束浓度很低，在水溶液中离解速度慢，因此纳米活性可在载体内停留较长时间，保证有足够的GLP纳米活性微粒到达人体病灶部位。

这些特性给药输送带来了方便，纳米活性微粒可通过物理的非化学链作用溶解进胶束或化学链合进胶束，同时还可以使纳米活性微粒具有靶向作用。

如孙岚等［7］采用纳米活性炭对小鼠腹腔注射，研究了体内的分布、存留，腹腔内淋巴靶向性十分明显。

这可以是由于活性炭被制备成纳米微粒后，表面结合和化学活性能有显著增高。

多糖类的壳聚糖作为与一种天然的可生物降解的高分子材料，在纳米微粒肿瘤靶向给药中也有报道; 将其制成纳米粒粒径在200~750 nm时，包封了DNA的壳聚糖有效被肠上皮的M细胞摄取，并最终又到了血清产生IgA达到免疫效果［8］，有效诱导细胞分化、凋亡、抑制肿瘤生长。

3 GLP纳米活性载运至肿瘤靶点的机制纳米活性载体根据不同的给药方式，可能的机制主要运用如下: (1)GLP纳米活性的消化道给药: 将大分子GLP (数千～数十万不等)改造成(300±50)纳米的微粒后。

经口服时通过小肠上皮细胞中的甘油硬脂酸通路，以乳糜微粒的形式靶向于肠系膜淋巴结。

近年来，纳米载体促进药物的消化道吸收屡见报道，在人和动物的小肠存在着与免疫有关的特定组织区域。

如集合淋巴小结占整个肠道黏膜的1/4左右。

研究发现，口服给药时，微粒剂可透过小肠上皮细胞，经过集合淋巴小结到达脾脏等淋巴系统器官，且粒度越小，吸收效果越好。

(2)GLP纳米活性的组织间隙给药: GLP改造后，当载药纳米微粒进行皮下、肌内、癌周等组织间隙给药时，纳米微粒同时面临着毛细血管和毛细淋巴管的转运和摄取。

其以何种途径为主则取决于载药粒子的性质，如粒径、表面电性等而定。

正如前述，由于内皮细胞间连接松散，常驻有许多开放的间隙存在，微粒和大分子物质可通过毛细淋巴管内皮细胞间间隙和内皮细胞的胞饮及吞噬作用进入毛细淋巴管内，然后通过淋巴引流到达区域淋巴结。

微粒和大分子物质的大小大部分在进入到毛细血管内时，数百纳米内的粒子则可被毛细淋巴管吸收，而数千的粒子则会长时间滞留在组织间隙的空间里。

因此大分子质量物质常常就不直接进入靶细胞，而是首先与分布在靶细胞表面的特异性受体或者配体结合，通过某些特定的信号通路，产生最终的生理效应。

4 GLP纳米活性对抑制肿瘤的靶向性作用GLP纳米活性的淋巴系统给药是以乳剂为载体，该剂型具有淋巴亲和性的特点。

局部注射乳剂后，可以聚集在区域淋巴结内，并有缓释药物的功能。

另有一些方式是针对消化道给药的纳米活性载体。

一般认为，油/水（O/W）型的靶向性要优于水/油（W/O）型，复乳优于单乳，乳剂的稳定性是影响淋巴摄取的一大因素［9］。

(1)GLP纳米活性有药效延长时间作用: GLP纳米微粒具有包含疏水性物质作内核制成的胶束。

一般植物为疏水性物质或半合成的中长链脂肪酸的甘油酯（如Miglyol或Panasate）。

研究表明: 有两种性质，第一种是局部以纳米囊给药，能经过组织靶向到淋巴结; 另一种是局部以纳米微乳给药，是由水相、油相、表面活性剂和助表面活性剂等四种体系组成，粒径在10~500 nm间的纳米乳剂，靶向淋巴后释药更为持久（可维持恒量水平达7 d，远大于参比的乳液和脂质体）。

由于其处方中亲脂性成分比例大，与淋巴具有一定的亲和性，加之粒径小、比表面积大，在淋巴转运时几乎没有障碍，也已被研究用以靶向淋巴肿瘤上。

(2)GLP纳米活性对抑制肿瘤靶向性: GLP纳米微粒是指纳米尺度范围的胶束，纤维素的化学结构和分子构象使其微溶于水和常用的药用有机溶剂，而对于纳米微粒的制备，在常用溶剂中有较高溶解度是必需的; 由于自身的特点，这一类给药方式就是靶向给药。

纤维素分子中存在大量羟基，可发生加成、取代、氧化等反应，从而得到其可溶性衍生物。

王学清等［10］采用羟丙甲纤维素酞酸以溶剂-非溶剂法制备环孢素A纳米微粒，注射入大鼠时相对提高生物利用度。

如壳聚糖-多柔比星（DOX）纳米微粒可包含相当含量的DOX ，该微粒稀释较少，保持了DOX的细胞毒活性。

共聚焦成像表明该微粒是通过胞吞途径进入细胞内，并在胞内释放DOX。

进一步的研究表明: 用微乳法制得的壳聚糖DOX/葡聚糖纳米微粒，粒径为(100±10) nm，可较好地透过实体瘤并保留其内，同时明显降低副作用并提高疗效。

5 结语将高MrGLP改造成(300±50) nm以下的低MrGLP(多肽)抗肿瘤制剂，该微粒具有优于原始分子的靶向性；纳米微粒给药机制相比于载体材料具有生物利用度与提高难溶药物水溶性及相关药代动力学等，载药方式可控，制备工艺简单等优点。