将 试 管 于 震 荡 机 上 ， 使 菌 液 混 合 均 匀
取出试管中的第一次十倍稀释菌液1mL， 加入另一个新的含9mL无菌水的试管中。 重复此步骤直至所需要的稀释浓度。
从最后稀释菌液中吸取 0.1mL菌液， 臵入准备好的无菌琼脂内。
将三角玻璃棒浸于酒精中
将三角玻璃棒在火焰上燃烧 （须注意勿使燃烧中的酒精滴入酒精瓶中，引起燃烧）
教具 多媒体
复习内容及形式
1、工业生产菌种筛选流程 2、工业菌种的育种技术 讲授内容及方法
时间分配 复习与提问： 5min 讲授：90min 总结：5min
思考题
1.自然界分离筛选菌种的步骤 2.发酵工业对菌种的要求
第二章 工业生产菌种筛选 程序及育种技术
第一节
工业生产菌种筛选流程
第二节
工业菌种的育种技术
处理菌悬液的制备
• 这一步骤的关键是制备单细胞和单孢子状态的、 活力类似的菌悬液，为此要进行合适培养基的 培养，并要离心，洗涤，过滤。
诱变处理
根据前面有关诱变剂及诱变处理的介绍， 结合诱变对象的实际，设计诱变处理方案。
中间培养
由于在发生了突变尚未表现出来之前，有 一个表现延迟的过程，即细胞内原有酶量的稀 释过程(生理延迟)，需3代以上的繁殖才能将 突变性状表现出来。这个过程对今后的筛选和 获得稳定菌株都是极为重要的。
3、大部分诱变剂是致癌剂，所以在使用中必须 非常谨慎，要避免化学诱变剂与皮肤接触，， 且切勿吸入其蒸气，有人对某些诱变剂极其敏 感，甚至未直接接触就会过敏，这就更要当心。
诱变剂的选择 1．碱基类似物和羟胺具有很高的特异性，但很少使 用，回复突变率高，效果不大。 2．亚硝酸和烷化剂应用的范围较广，造成的遗传损 伤较多。其中亚硝基胍和甲基磺酸乙酯常被称为 “超诱变剂”，甲基磺酸乙酯是毒性最小的诱变 剂之一。 3．吖啶类诱变剂可以造成生化代谢途径的完全中断。 4．紫外线仍十分有效。电离辐射是造成染色体巨大 损伤的最好诱变剂，它能造成不可回复的缺突变。 但它可能影响邻近基因的性能。
（二）诱变育种步骤 •出发菌株的选择 •处理菌悬液的制备
•诱变处理
•中间培养
•分离和筛选
出发菌株的选择
1．自然界新分离的野生型菌株，对诱变处理较 敏感，容易达到好的效果。 2．在生产中经生产选种得到的菌株与野生型较 相像，也是良好的出发菌株。 3．每次诱变处理都有一定提高的菌株，往往多 次诱变能积累较多的提高。 4．出发菌株开始时可以同时选2～3株，在处理 比较后，将更适合的出发菌株留作继续诱变。
5. 要尽量选择单倍体细胞、单核或核少的多细 胞体来作出发诱变细胞，这是由于变异性状大部 分是隐性的，特别是高产基因。 6．根据采用的诱变剂或根据细胞生理状态或诱 变谱选择诱变剂，因为同一诱变剂的重复处理会 使细胞产生抗性，使诱变效果下降。有的诱变剂 是作用于营养细胞，就要选对数期的细胞：有的 作用于休止期，就可选用孢子。
菌种鉴定
生理生化鉴定
遗传学鉴定
（五）毒性试验 • 自然界的一些微生物是在一定条件下产毒 的，将其作为生产菌种应当十分当心，尤其与 食品工业有关的菌种，更应慎重。据有的国家 规定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲 霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试 验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以 上的毒性试验。
步骤九
重复第六以及第七步骤，由第八步骤的第三 区中划出第四区，划满剩下的空间。完成后 的营养平板，如右上图。
步骤十
在营养平板上贴好标签，标 示好接种日期、操作者姓名、菌 种学名以及培养基名称。
固体培养基的稀释涂抹接种法
需要使用的仪器——震荡机
吸取准备好欲稀释的菌液
吸取充分均匀后的菌液
取含有 9mL无菌水之试管，将试管口过火灭菌。 将菌液臵入，此时试管须做记号为第一次稀释。
（三）培养（纯种）分离 • 尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于 微生物的混杂生长状态。因此还必须分离，纯 化。在这—步，增殖培养的选择性控制条件还 应进一步应用，而且控制得细一点，好一点。 纯种分离的方法有划线分离法、稀释分离法。
固体培养基四区划法接种法
步骤一
接种针先以火焰灭菌法灭菌
步骤二
轻触营养平板上无菌的琼脂处冷却
自然突变有两种情况： 一种是我们生产上所不希望看到的，表现为菌株的衰 退和生产质量的下降，这种突变成为负突变。 另一种是我们生产上希望看到的，对生产有利，这种突 变成为正突变。 问题： 高产菌株是正突变高，还是负突变 回复突变：高产菌株在传代的过程中，由于自然突变导 致高产性状的丢失，生产性能下降，这种情况我们称为回复 突变 自然选育虽然突变率很低，但却是工厂保证稳产高产的 重要措施。
使用玻璃棒将菌液均匀涂布开来，将培养皿臵 于恒温培养箱中隔天观察菌落数目，再依照稀释倍 数推算出菌液浓度。
•
从自然界中分离培养微生物是菌种选育的重 要和基础的步骤。 • 到目前为止，还没有一种分离培养方法能揭 示一个试样中所包含的所有微生物总数和种类。 • 在任一试样中所存在的微生物仅为极少数特定种 类的菌株；在工业微生物筛选过程中，应及时调 整检测方法，以与各种不同类型的生长和代谢之 微生物相适应。 • 因此，建立一更为科学的和针对性不强的分离方 法是必要的。
分离和筛选 • 筛选分初筛和复筛。初筛以迅速筛出大量的达到 初步要求的分离菌落为目的，以量为主。 • 复筛则是精选，以质为主，也就是以精确度为主。 因此在具体方法上就有差异. 例如初筛可以在平皿上直接以菌落的代谢产物与 某些染料或基质的作用形成的变色圈或透明圈的 大小来挑取参加复筛者，而将90%的菌落淘汰。 在数量减少后就要仔细比较参加复筛和再复筛的 菌株，最后才能选得优秀菌株。在以后的复筛阶 段，还应不断结合自然分离，纯化菌株。
步骤三
以接种针轻触菌落，使接种针上沾有细菌。
步骤四
更换一个新的无菌营养平板
步骤五
将接种针上的细菌划于一个新的营养平板 上。此为第一菌区 。
步骤六
重复第一步骤，将接种针以火焰灭菌法 灭菌，然后轻触琼脂无菌处冷却。
步骤七
由第五步骤的第一区中划出第二 区，如右上图。
步骤八
重复第六以及第七步骤，由第七步骤的 第二区中划出第三区，如右上图。
第二节
工业菌种的育种技术
• 工业菌种的育种： 是运用遗传学原理和技术对某个用于特定 生物技术目的的菌株进行的多方位的改造。通 过改造，可使现存的优良性状强化，或去除不 良性质或增加新的性状。
工业化菌种的要求
能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成
产物
有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的
• 一、自然选育
• 不经过人工处理，利用微生物自然突变而进行 的菌种选育过程。 ⒈ 从自然界分离获得菌株 • • • • ⑴ ⑵ ⑶ ⑷ 采样 增殖培养 纯种分离 生产性能的测定 划线法
稀释法
一般习惯上将自然选育 称为菌种的分离纯化。
• ⒉ 从自发突变体中获得菌株
• 自然突变是指在自然条件下出现的基因变化。 • 微生物的代谢调节系统趋向于最有效地利用环境 中的营养物质，优先进行生长和繁殖，而生产菌 种（突变株）常常是打破了原有的代谢调节系统 的突变株，因此常常表现出生活力比野生菌株弱、 遗传特性不够稳定的特点。
第一节
工业生产菌种筛选流程
一、菌种的来源
• 根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂 或菌种保藏部门索取或购买； • 从大自然中分离筛选新的微生物菌种。 • 从一些发酵产品中分离出来所需菌种。
二、分离思路
• 新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照 生产的要求、菌种的特性，采用各种筛选方法， 快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。 • 实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必 须重新进行分离纯化。 • 有了优良的菌种，还要有合适的工艺条件和合 理先进的设备与之配合。
教
课程：发酵技术 班级：生物09级 课题
案
任课教师：李懿 教研组长签字： 授课类型 讲授
第二章 工业生产菌种筛选程序及育种
教学目的
1.了解生物活性物质产生菌的筛选方法与过程， 2.掌握自然育种、诱变育种、杂交育种、原生质体融合技术育 种及基因重组技术育种的原理与方法。 1. 微生物代谢产物分哪两类？ 2.简述发酵工程的内容
可操作性要强
遗传性能要相对稳定 不易感染它种微生物或噬菌体
产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病
菌无关）
生产特性要符合工艺要求
经验 育种 菌种 选育
自然 选育 诱变 育种 杂交 育种
主要通过突 变和筛选来 育种
常规的杂交 育种
定向 育种
分子 育种
原生质体 融合
通过DNA重 组技术来育 种
诱变
物理、化学或生物诱变方法
（一）诱变剂和诱变处理 诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂 物理诱变剂：射线如紫外线、X—射线、γ—射线， 快中子； • 物理因素中目前使用得最方便而且十分有效的是紫 外线。许多高产菌株的选育都用过紫外线，对于一 般实验室、中小型工厂都适用，也很安全。 • 其他的几种射线都是电离性质的，有一定的穿透力， 一般都由专业人员在专门的设备中使用，否则有一 定危险性。
三、新种分离与筛选的步骤
• 定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长 培养特性。 • 采样：有针对性地采集样品。 • 增殖：人为地通过控制养分或培条件，使所需菌 种增殖培养后，在数量上占优势。 • 分离：利用分离技术得到纯种。 • 发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性包 括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、 发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生 长和发酵最适温度、最适pH值、提取工艺等。
（四）筛选
•
这一步是采用与生产相近的培养基和培养 条件，通过三角瓶的容量进行小型发酵试验， 以求得适合于工业生产用菌种。