图位克隆基因研究进展宋成标摘要图位克隆是在不清楚基因产物结构和功能的情况下，根据基因在染色体上都有稳定的基因座实现的。
随着各种分子标记技术和高质量基因组文库构建技术的发展，图位克隆现已经成为分离生物体基因的一种常规技术。
本文主要概述了图位克隆的一般步骤，包括目的基因的初步定位、精细定位和遗传做图、染色体步行和登陆及利用功能互补实验鉴定目的基因。
最后，对图位克隆技术存在的局限和发展前景作了初步的分析。
关键词图位克隆, 分子标记, 精细定位, 基因组文库Abstract Map-based cloning is based on the functional genes have their particular gene locus on chromosomes,when we know about the structure and function of gene products unclearly.With the rapid development of molecular marker technologies and constructing high quality genomic library technologies, map-based cloning had already become a common bio—technique for gene isolation. This article summarized mainly the processes of the map-based cloning in principle,including first-pass mapping of candidate gene、fine scale-mapping and building genetic map、chromosome walking or landing and finally complement experiment for identifing candidate gene. Finally the problems and the prospects in the map-based cloning are analyzedKeywords Map-based cloning, Molecular marker, Fine maping, Genomic library从遗传学观点来看，基因克隆有两条途径：正向遗传学途径和反向遗传学途径。
正向遗传学途径指的是通过被克隆基因的产物或表型突变去进行，如传统的功能克隆及近年来迅速发展的表型克隆；反向遗传学途径是根据被克隆的目的基因在染色体上都有稳定的位置来实现的。
由于在多数情况下，我们并不清楚基因产物的结构和功能，很难通过正向遗传学途径克隆基因，而反向遗传学途径则显示了较好的前景。
其中可以利用的主要有三种方法，分别是转座子标签法、随机突变体筛选法和图位克隆法。
转座子标签法中受转座子的种类、转座频率及有些植物存在内源转座子等的影响，随机突变体筛选法则随机性较大且不能控制失活基因的种类和数量等，限制了它们的应用。
图位克隆（map-based cloning）又称为定位克隆（positional cloning），1986年首先由剑桥大学的Coulson 等提出，用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的，无需预先知道基因的DNA序列，也无需预先知道其表达产物的有关信息。
它是通过分析突变位点与已知分子标记的连锁关系来确定突变表型的遗传基础。
随着模式物种（拟南芥、水稻）全基因组测序的完成，各种分子标记技术的发展促进了高密度分子标记连锁图谱的建立和各种数据库的完善。
图位克隆技术越来越成熟，已经成为分离生物基因的一种常规方法。
本文将对图位克隆技术的相关策略作一介绍。
1图位克隆的策略自1992年图位克隆技术首次在拟南芥中克隆到ABI3(Girauda et al., 1992)基因和F AD3 (Arondel et al., 1992)基因以来，图位克隆技术在其它相关技术快速发展的支持下迅速发展起来。
它是依据功能基因在生物基因组中都有相对稳定的基因座，在利用分子标记技术对目的基因进行精细定位的基础上，用与目的基因紧密连锁的分子标记筛选已构建的DNA文库（如Cosmid、YAC、BAC等文库），构建出目的基因区域的遗传图谱和物理图谱，再利用此物理图谱通过染色体步行、跳跃或登陆的方式获得含有目的基因的克隆，最后通过遗传转化和功能互补实验来验证所获得的目的基因（图1）。
初步定位（First-pass maping）-------构建遗传图谱（constructing genetic map）-----精细定位（fine maping）---------构建物理图谱( constructing physical map)------染色体步移、登陆（chromosomal walking、landing）-------确定侯选基因（Consider candidate genes）----遗传互补验证目的基因（Through genetic complementation (transformation) to identify candidate gene）（请帮我画一个简易图表，把内容填进去）图1 图位克隆的主要步骤Figure 1 Key steps in map-based cloning process2图位克隆相关技术的发展大片段DNA克隆载体的发展和高密度的DNA分子连锁图谱的构建为图位克隆技术的实际应用成为了可能，而一些模式生物基因组测序的完成，则使在这些生物及同科属生物间图位克隆一个目的基因的时间大为缩短。
2.1 高质量、容易操作的基因组文库的构建基因组大片段插入文库的发展主要经历了噬菌体和Cosmid文库和人工染色体文库。
作为第一代文库发展的代表噬菌体和Cosmid文库虽然比较稳定、易分离及转化率高等优点，但插入的片段较小，都在25 ~ 45Kb之间。
图位克隆理论上可以适用于任何生物，但主要还是用于真核生物。
真核生物一般含有大量的内含子，只有容纳大片段插入子的克隆载体，才能携带完整的基因。
人工染色体的出现基本上克服了DNA容载的问题，最旱发展的人工染色体是YAC。
1983年Murray等（文后无此文献，请补充,已补充）首次构建了总长度为55Kb的Y AC。
1987年Burke等（文后无此文献，请补充,后面有）得到了能够克隆大片段DNA的YAC载体。
证明Y AC可以构建高等生物的完整基因组文库。
酵母人工染色体（YAC）具有着丝粒（CEN）、端粒（TEL）及复制起始点（ARS），能够在酵母细胞中自主复制。
Y AC尽管有较大的容量，但也存在着一些缺陷：(1) 嵌合现象(chimeric phenotype)的存在(占全部克隆的40% ~ 60%)。
在同一Y AC克隆中嵌合两个不连续的大片段，来自不同染色体或同一染色体的不连续的区域，这些克隆很不适合测序和作图工作；(2) 稳定性差(unstability)，在一些克隆中存在序列重排(sequence rearrangem ent)和插入丢失(insert deletion)现象；(3) 插入DNA分离与纯化困难；(4) 转化效率低。
这些缺点限制了YAC的应用。
后来陆续发展了P1，BAC，PAC等几种以细菌为寄主的载体系统。
值得提及的是进展一直缓慢的哺乳动物人工染色体(MAC)和人类人工染色体(HAC)也已取得突破性进展。
2.2分子标记技术的发展实现基因图位克隆的关键是筛选与目标基因连锁的分子标记。
实质上，分子标记是一个特异的DNA片段或能够检出的等位基因，对其有效地利用即可达到图位克隆基因之目的。
迄今为止，已有几十种技术可用于分子标记的筛选。
其中常用的有限制性内切酶酶切片段长度多态性标记（restriction fragment length polymorphism, RFLP）、随机扩增多态性DNA（randomly amplified polymorphic DNA, RAPD）、测定序列标签位点（sequence tagged site, STS）、表达序列标签（expressed sequence tag, EST）、单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisim, SNP）、简单顺序长度多态性（simple sequcuce length polymorphism, SSLP）、简单重复顺序即微卫星DNA标记（simple sequence repeat, SSR）、扩增的限制性内切酶片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism, AFLP）等。
这些技术有别于最初的形态标记、细胞学标记和生化标记，一般表现出稳定、可靠的特点，有的使用成本也相对较低，特别适用于筛选与目标基因紧密连锁的标记，尤其是与目标基因共分离的标记。
因此能够加快克隆基因的进程，研究者可依据不同的研究目标、对象、目的、条件等，选择使用这些技术。
另外随着分子标记技术的发展，一些植物的遗传图谱构建和比较基因组的研究也取得了很大的进步，现在已经建图的植物达十几种物，其中包括了所有重要的农作物，水稻、玉米、蕃茄、小麦、马铃薯、拟南芥等重要经济作物和模式植物的遗传图谱已相当精细，含有数百甚至数千个标记。
如Harushima等(1998)将水稻图谱的分子标记加密到2275个，总遗传距离达到1521. 6cM；同时Takashi等（1998）利用水稻的2 275个分子标记筛选到了2976个Y AC克隆，其中2 445个克隆已被定位于遗传连锁图上，这些阳性克隆组成了213个跨叠克隆群，覆盖水稻基因组约63%；到2001年定位到该图谱上的分子标记己达3000多个，这为克隆基因和研究基因表达及调控奠定了基础。
随着比较基因组学的兴起. 可以利用同科异种间染色体的共线性以模式植物为种间图位克隆中介来克隆其它植物基因。
Kilian 等（1997）曾以水稻为图位克隆中介来克隆大麦杆锈病抗性基因Rpgl和Rpg4，并建立了3.6个分子标记/0.1cM的区域高密度分子标记连锁图，而且鉴定了一个覆盖Rpgl区域的水稻BAC克隆，精细作图证明一个20 Kb水稻基因组片段包含Rpgl两侧的分子标记。
3图位克隆的一般步骤3.1筛选与目标基因连锁的分子标记这一步相当于对目的基因在染色体上进行初步定位，利用分子标记技术在一个目标性状的分离群体中把目的基因定位于一定的染色体区域内。