实验三叶绿体色素的提取、分离及理化性质的测定
【实验原理】
叶绿体色素又称光合色素，在高等植物中可分为叶绿素和类胡萝卜素两大类，前者包括叶绿素a（蓝绿色）和叶绿素b（黄绿色），后者包括胡萝卜素（橙色）和叶黄素（黄色），它们与类囊体膜上的蛋白质结合形成色素蛋白复合体，不溶于水，易溶于酯，因此可用丙酮、乙醇、石油醚等有机溶剂进行提取。
叶绿体色素的分离有多种方法，本实验仅介绍纸层析法。
层析的基本原理：在分离过程中，由一种流动相（即一种液体或气体）带动着试样经过固定相（一种支持物，如纸）向外扩散，由于试样在两相中的溶解度不同和固定相对试样中不同成分的吸附程度有别，当用适当的溶剂推动时，混合物中各成分在两相间具有不同的分配系数，所以它们的移动速度不同，经过一定时间层析后，可使试样中的各种组分得到分离，在做纸层析时，由于纸对光合色素中各种色素分子的吸附程度不同，以及这些色素分子在溶剂四氯化碳（推进剂）中溶解度也有差异，以致溶剂带动色素分子向四周移动时，各种色素分子沿纸扩散的速度也就不同，使混合色素分离，出现不同颜色的环。
将提取的叶绿素溶液置于光下，在透射光呈绿色，在反射光下呈樱桃红色，这种现象称为荧光现象。
在反射光下叶绿素溶液之所以呈樱桃红色，是因为叶绿色分子吸收光能后处于激发状态，激发态的叶绿素分子很不稳定，当它回到基态时，将所获得的能量以辐射能的形式发射出红光量子。
叶绿素的化学性质很不稳定，容易受强光、高温等的破坏，特别是当叶绿素与蛋白质分离以后，破坏更快，而类胡萝卜素则较稳定。
叶绿素中的镁可以被H＋所取代而成褐色的去镁叶绿素，后者遇铜后，其中的氢（H＋）又被铜（Cu2＋）取代，形成了铜代叶绿素，便由褐色转变成蓝绿色，铜代叶绿素很稳定，且比原来的绿色还要稳定些，在光下也不易被破坏。
【材料、设备与试剂】1. 材料新鲜的菠菜或小白菜等其他绿色植物叶片。
2.设备电子天平、研钵、烧杯、量筒、培养皿、刻度试管、试管夹、试管架、酒精灯、剪刀、圆形滤纸、小漏斗等。
3.试剂丙酮、四氯化碳、无水硫酸钠、6?mol/L盐酸、醋酸铜粉末、碳酸钙等。
【方法与步骤】1. 叶绿体色素的提取1.1 取菠菜或其他植物新鲜叶片5?g，洗净，擦干，去掉主脉后剪碎，放入研钵中。
1.2 在研钵中加入少量碳酸钙和约3-5?mL 丙酮后，研磨成匀浆，研磨过程中根据情况加入一定量的丙酮以利于研磨，匀浆用多层纱布过滤到试管中。
1.3 在残渣中再加入3~5?mL 丙酮，研磨过滤，共得深绿色溶液近10?mL，其中含有叶绿素a、叶绿素b、叶黄素、胡萝卜素等色素及其它脂溶性物质。
2. 叶绿体色素的分离2.1纸层析分离法纸层析装置如图8.1 所示。
具体操作为：2.1.1 先用滤纸条（2?cm×4?cm）沿长度方向卷成一个紧实的纸芯。
2.1.2 取一张圆形层析滤纸（直径11?cm，略大于培养皿直径），在其中心位置钻一个纸芯粗度的圆形小孔（滤纸不能折叠），将卷好的纸芯一端插入孔内少许，并剪去纸芯上端多余部分，使纸芯上端与滤纸恰好平齐，下端长约 1.5?cm（与培养皿盖高度同）。
2.1.3 把这个带纸芯的圆形滤纸，平放在干净的培养皿上，用细玻璃滴管吸取少量叶绿体色素的丙酮提取液，小心地滴入纸芯上端7-10 滴。
注意：一定要在色素斑点稍风干后，再滴入另一滴，而且液滴不能污染滤纸。
2.1.4 向培养皿中倒入适量（约为培养皿高度的1/3 左右）四氯化碳，并加入一勺（适量）的无水硫酸钠，使纸芯下端浸入其中，并立即盖上培养皿。
此时，推动剂借毛细管引力顺纸芯扩散至圆形滤纸上，并把叶绿体色素向四周推动，数分钟后，就可见到滤纸上出现四或五个颜色不同的同心环，并逐渐扩大。
2.1.5 当推动剂前沿接近滤纸边缘时（约30?min 左右），取出滤纸，即可看到分离的各种色素，用铅笔标出各种色素的位置和名称，并绘简图示之或拍摄图片。
3. 叶绿体色素的理化性质3.1荧光现象观察叶片丙酮提取液（稀释前的浓提取液）在反射光和透射光下的颜色有何不同并拍摄图片。
叶绿体色素溶液在反射光下呈樱桃红色，在透射光下呈绿色，说明原因。
3.2 光对叶绿素的破坏作用取叶绿体色素提取液少许，分装于2 支试管中，一支放在黑暗处（或用黑纸遮光）；另一支放在强光下（阳光直射），经0.5~1?h 后，观察2 支试管中溶液颜色有何不同并拍摄图片。
3.3氢和铜对叶绿素中镁的取代作用 3.3.1 取 2 个试管，A 管中加入稀释后的叶绿体色素提取液2?mL，作为对照；在B管中加入稀释后的叶绿体色素提取液5?mL并加入1~2具体操作为：2.1.1 先用滤纸条（2?cm×4?cm）沿长度方向卷成一个紧实的纸芯。
2.1.2 取一张圆形层析滤纸（直径11?cm，略大于培养皿直径），在其中心位置钻一个纸芯粗度的圆形小孔（滤纸不能折叠），将卷好的纸芯一端插入孔内少许，并剪去纸芯上端多余部分，使纸芯上端与滤纸恰好平齐，下端长约1.5?cm（与培养皿盖高度同）。
2.1.3 把这个带纸芯的圆形滤纸，平放在干净的培养皿上，用细玻璃滴管吸取少量叶绿体色素的丙酮提取液，小心地滴入纸芯上端滴浓盐酸，摇匀，溶液变为褐色，拍摄图片，此时叶绿素中的镁（Mg2＋）被氢（H＋）取代而生成了去镁叶绿素。
3.3.2 从B 管中分出一半装人C 管，作为对照，在 B 管余下的溶液中加入一小粒醋酸铜结晶，将B 管和C 管都在酒精灯上慢慢加热，则B 管中的溶液又转变在蓝绿色，拍摄图片，这是因为其中的氢（H＋）又被铜（Cu2＋）取代，形成了铜代叶绿素。
以叶绿素a为例，反应过程如下：
【注意事项】（1）研磨叶片要充分，否则提取的叶绿体色素溶液浓度稀，荧光现象不明显。
（2）纸层析时，纸芯一定要卷实，分离色素用的圆形滤纸在中心打的小圆孔周围必须整齐，否则分离的色素不是一个同心圆。
（3）色素的提取、展层均应在弱光或暗室内绿光下进行，以防止光破坏色素，影响实验结果。
（4）实验用的有机溶剂较多，且都易挥发，取时动作要快、取后要随时加盖。
3.3氢和铜对叶绿素中镁的取代作用3.3.1 取2 个试管，A 管中加入稀释后的叶绿体色素提取液2?mL，作为对照；在B管中加入稀释后的叶绿体色素提取液5?mL并加入1~2
【思考题】（1）图示叶绿体色素纸层析结果，用铅笔分别标出叶绿素 a 和叶绿素b、叶黄素、胡萝卜素。
（2）研磨提取叶绿体色素时加入CaCO3和石英砂各有什么作用？（3）根据Cu2＋在叶绿素分子中的替代作用，对制作绿色标本有何指导意义？
【作业】请写出电子版实验报告并上传至老师邮箱（需附图片；需回答上述 3 个问题）。
（由任课教师李仲芳摘编，仅供参考）。