Marshall W. Nirenberg Har G. Khoranat信使RNA 麟密码tDNA浙江万里学院基因工程期末复习考点第一章绪论1. 分子生物学与基因工程发展的代表性事件：（客观题） 1928年,Griffith 实验——肺炎双球菌体内转化实验，证明了转化因子（DNA ）是遗传物质,没有得出蛋白质与遗传物质的关系1944年，Avery 实验——体外转化实验，证实了蛋白质不是遗传物质。
1952年，Hershey-Chase 实验一一利用放射性同位素标记大肠杆菌T2噬菌体的捣碎实验证 明了遗传物质是DNA,而不是蛋白质。
1953年，沃森和克里克发现了 DNA 双螺旋的结构，开启了分子生物学时代。
威尔金斯富兰克林（填空）1958年，Matthew Meselson Franklin Stahl 采用氯化艳密度梯度离心法验证DNA 复制的半保留复制Robert W. Holley 1965年破译了所有氨基酸的密码子2. 镰刀型贫血：氨基酸突变血红蛋白亚基N 端的第六个氨基酸残基是缴氨酸（val ）,而不是下正常的谷氨酸残基（Glu ）。
ttGAAGUAt tC T T 值出| C AT “A A\ 反rpj A A A A ■ ' — ■ A 」A GAA 突变 G TA嫌刀型细胞贫血控必因的图解3. 胰岛素（公司+事件）1921年，加拿大科学家Banting 和Best 发现胰岛素，是糖尿病治疗史上的里程碑 1922年，开始用于糖尿病的治疗胰岛素发现四人组”：Banting 、Best 、科利普和麦克莱德1922年5月，多伦多大学与礼来公司（EliLilly and Company ）it 成协议，由科学家们帮助礼来 开展胰岛素的规模生产。
因苏林：第一支商业化胰岛素的诞生1982年5月14 口，礼来向美国FDA 提交了生物合成人胰岛素NDA18-790的申请 1982年10月28日，FDA 发布了批准书，第一支基因重组人胰岛素正式上市 1997年，第一支基因重组人胰岛素进入中国Sanger 测序法：蛋白质的结构和功能是由氨基酸序列所决定的中国科学家的贡献：人工合成牛胰岛素1973年，斯坦福大学的Stanley Cohen 和加州大学旧金山分校的Herbert Boyer 合作发表了一 篇学术论文一一重组DNA 技术4.1990年，美国批准了第一例临床基因治疗申请，患者为四岁女孩Ashanti de Silva,由于 缺乏腺苜脱氢酶ADA 基因而患有严重综合性免疫缺陷症，研究者W.F. Anderson 将ADA 基因 导入患者的淋巴细胞，然后将经改造的淋巴细胞回输到患者体内，取得了成功。
5.HIV被治愈唯一成功的例子：柏林病人Endonucleas eBam HI ECO RI Hind III Hae III PstJ Q |QATC C CCTAG I —► 8 CCTAG GATCC G "Sticky- ends GjAATTCCTTAAG —► Ki CTTAA AATTC G “Sticky” ends AAGCTT TTCGAlAv *—► M TTCGA AGCTTA "Sticky” ends G CC GGc(M Blunt C GGCCGGendsCTGCAG GACGTC —►CTGCAG G ACGTC “Sticky” ends CCCGGGccc GGG6.基因编辑技术：ZFN 锌指核糖核酸酶、TALEN 转录激活因子样效应物核酸酶、CRISPR/Cas9第二章基因操作的工具酶L 限制性核酸内切酶的作用：能在特异位点（酶切位点）上催化双链DNA 分子的断裂，产生相应的限制性DNA 片段 切割不同来源的DNA 分子将产生特征性限制性酶切图谱，具有重大应用价值（分子手术刀）2.细菌细胞内特异性降解外源核酸分子的核酸酶，其作用特点是：（知道）特异性降解异源DNA 分子（甲基化修饰差异）I 类限制酶随机切割双链DNA 分子，II 类限制酶识别、切割特殊的回文（对称）序列 3. 核酸工具酶分类：核酸水解酶类：核酸内切酶、核酸外切酶（填空） 核酸合成酶类：DNA 聚合酶、RNA 聚合酶、DNA 连接酶核酸修饰酶类：甲基化酶、核甘酸激酶、核昔酸转移酶、磷酸酶4.56. 一种限制酶只能识别一种特定的核昔酸序列，并在特定的切割点上将DNA 分子切断7. 分子剪刀——限制性内切酶%1 分布：主要在微生物中%1 作用特点：专一性：一种限制酶只能识别一种特定的核苻酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA 分子多样性：限制酶有200多种%1 结果：产生黏性末端或平末端（填空）8. 判断粘性还是平末端DNA sequence Cleavage products9 .限制性内切核酸酶和甲基化酶一起称为限制一修饰系统5' ： | | [ "AA丁TCEcoRI IE CO RI. 「' —1 「1限制:作用|修饰作用］S' [ | 5f/XAT TC I I | i | 3" 5’ yr I n I I^A A J" TC—rrT-rr S'3。
「TAA5* 3'(3 1J JJJ 5> 3, Il 山 1 [5 T・ ViG、n【’’ 3,EcoRIT110.内切核酸酶分为三类：即I型、II型、HI型酶，通常所用的限制性内切核酸酶是指II型表2.1限制性内切核酸酶类型及主要特性特性I型11型皿型限制和修饰活性双功能的酶核酸内切酶和甲基化酶分开双功能的酵桐市rfq Z¥ T K H3种不同的亚基单一亚基两种不同的亚基限制作用所需的辅助因子ATP、Mg2*Mg2*ATP、Mg2 +特异性识别位点非对称序列回文对称结构非对称序列切割位点在距识别位点至少lOOObp 的地方随机的切割位于识别位点上距识别位点下游24~26bp 处序列特异的切割不是是是在基因工程中的应用无用广泛使用用处不大11.采用Smith和Athens提议的方案，根据限制性内切核酸酶来源和菌株命名（选择判断）a)b)c)d)e) Eg.Hind 用来源细菌的英文缩写斜体符号命名它的第一个字母大写，来源细菌属名的第1个字母第二、三字母小写，来源细菌种名的头2个字母第四个字母代表菌株最后用罗马字母表示同一菌株中不同限制酶的编号III代表从流感噬血杆菌（Haemophilus influenzae） d株中分离到的第3个限制酶12.不同限制性内切酶切割的三种结果：（填空）a.产生5'突出粘性末端cohesive end (EcoR I)5 ' ------- G|AATT C ---- 3' 5 ' -------------------------- p OH AATTC --------------- 3'3 ' —-C TT叫G一-5' EcoR I 3 ' —- TTA&H pG---5'b.产生3'突出粘性末端（Pst I> Bam H I ）c.产生平末端blunt end （Nru I）13.同尾酶（判断题）BamH I和Bglll, Sal I和Xho I14.限制性内切核酸酶Hpall和Mspl是同位酶，切割同样的DNA序列CCGG,但对这个序列的甲基化状态有不同的限制性反应Mspl切割所有状态下的CCGG序列，而Hpall仅切割非甲基化的CCGG序列。
这样Mspl被用来识别所有的CCGG序列，而Hpall能用来确定是否甲基化15.影响内切酶酶切反应的条件（简答，如何调整）%1温度：一般37°C%1盐离子浓度：Na+, Mg2 +%1缓冲体系：具有稳定pH环境的Tris-HCI缓冲体系，DTT用于保持酶稳定性和活性%1反应体积和甘油浓度：商品化的限制性内切核酸酶均加50%甘油作为保护剂，一般在-20°C保存。
酶切反应时，加酶的体积一般不超过总反应的10%,否则甘油浓度过高，影响酶切反应%1反应时间：通常为lh；（不超过4h,否则产生非特异性结合，HF-高保真酶）进行大量DNA酶切反应时一般让酶解过夜%1DNA纯度和结构：一个酶单位定义：lh内完全酶解lMgX噬菌体DNA所需的酶量DNA样品中所含的蛋白质、有机溶剂、RNA等杂质会影响酶切反应的速度和完全程度；酶切的底物一般为双链DNA, DNA的甲基化位置（用甲基化酶切割）会影响酶切反应评估DNA是否满足酶切条件：跑胶看下面有没有亮条带酶切反应注意事项：价格昂贵；决不能用水稀释，以免变性失活；预先加入除酶以外的所有其他试剂；取酶立即放于冰上。
分装小份避免反复冻融；使用无菌的新吸头；少加水，使体积最小，但保证酶液体积不超过总体积的10%,否则酶液中的甘油会抑制酶活性16.“星”活性产生非特异性切割17.DNA连接酶：催化DNA上裂口两侧（相邻）核苜酸裸露的3'羟基和5’磷酸之间形成共价结合的磷酸二酯键（梯子的扶手），不是狙键（梯子的踏板）），使断开的DNA裂口连接起来（填空）结果：使粘性末端（平末端）连接起来，粘性末端效率高（判断题）18.DNA连接酶的作用过程（简答）1）连接酶与辅助因子ATP或NAD +形成酶-AMP复合物2）AMP作用于DNA缺口的5'-末端磷酸基团3）缺曰3' -0H对活跃的磷原子作亲核攻击，形成新的磷酸二酯键，封闭切口19.DNA连接酶的反应条件连接反应的温度是影响转化效率的最重要参数。
多数内切酶产生的粘性末端的Tm值在15°C 以下，然而保持连接酶活性的最佳反应温度却是37°C但在该温度下，粘性末端之间的氢键结合是不稳定的，因此最适温度是粘性末端的Tm值和连接酶最适温度的折衷，所以连接反应一般采用16°C过夜20.平末端DNA片段的连接（了解，客观）a）直接用T4DNA连接酶连接：效率不高，较少采用b）同聚物连接平末端DNA片段：先用末端核昔酸转移酶，给平末端DNA分子加上同聚物尾巴后再用DNA连接酶进行连接1)2) 3) c ）用衔接物连接平末端DNA 分子：目的是在平末端分子上构建限制性核酸内切酶酶切 位点，经酶切后产生特异的粘性末端，从而与具有互补末端的DNA 连接21. 重组DNA 实验的一般程序（掌握）选用一种对载体DNA 只具唯一限制识别位点的限制酶（如EcoRI ）作位点特异的切割， 形成全长的具粘性末端的线性DNA 分子再将外源DNA 片段也用同一种酶作相同的消化混合，加入DNA 连接酶。