tetramethyl ethylene diamine, 简称TEMED)的
作用下,聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。
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实验原理
设计试验
聚丙烯酰胺凝胶电泳按其有无浓缩效应分为连
生 续及不连续系统，在连续系统中凝胶总浓度、缓 物 冲液PH均相同，带电颗粒在电场作用下主要靠电 化 荷及分子筛效应得以分离；在不连续系统中缓冲 学 液离子成分、PH、凝胶总浓度及电位梯度均不连 实 续，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应和分 验 子筛效应，还具有浓缩效应，可使稀的样品在电
生
生物化学实验
物 化
设计试验
学 实
主讲：刘连芬
验
聊城生命科学学院
E-Mail：liulianfen@
生命科学学院பைடு நூலகம்
设计试验
相关知识背景
聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel
生 electropHoresis, PAGE）是以聚丙烯酰胺为支 物 持介质的电泳。聚丙烯酰胺是由单体丙烯酰胺
物 1.准确称取新鲜材料3g，加入9ml 提取缓冲液
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生 物 化 学 实 验
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试剂
1、1mol/L盐酸48.0 mL Tris 36.6g TEMED 0.24 mL
生
物
2、Acr 28.0g
Bis 0.753g
化 3、过硫酸铵 0.14- 0.3g
学
4、1mol/L盐酸48 mL Tris 5.98g TEMED 0.48 mL
化 （acrylamide. Acr）和交联剂N, N’-甲叉双丙烯
学 酰胺（methylene-bisacrylamide, Bis）在催化
实 剂过硫酸铵（ammoniumpersulfate(NH4)2S2O8
验
简称AP）或核黄素(ribofavn即vitamin B2)和加 速剂N, N, N’, N’-四甲基乙二胺(N,N,N’,N’-
中均有三羟甲基氨基甲烷（简称Tris）及HCI。Tris的作用是
生
维持溶液的电中性及PH值，是缓冲配对离子。HCI在任何溶 液中均易解离出Cl-，在电场中迁移率快，走在最前面成为快
物 离子。电极缓冲液中的甘氨酸（Gly）,其pI=6.0在PH8.9的电
化 极缓冲液中,易解离出甘氨酸根（NH2CH2COO－），而在
物 各种血清蛋白。进入同一孔径的小孔胶时, 蛋白分子量小且
化 为球形的蛋白质分子所受阻力小,移动快,走在前面；反之阻
学
力大,移动慢,走在后面,从而通过凝胶的分子筛作用将各种蛋 白质分成各自的区带。
实
3.电荷效应 进入pH8.9的分离胶中,各种蛋白所带净电荷
验 不同,而有不同的迁移率。表面电荷多,则迁移快；反之则慢。
可以与迁移率高而处于低电位梯度的离子具有相应的速度
生 （即E高m慢=E低m快）,电泳开始后,由于快离子迁移率最
物 化
大,就会很快超过蛋白质,因此在快离子后面形成一个离子浓 度低的区域,即低电导区,电场强度与电导成反比关系：I=Eη, 式中E为电场强度,I为电流强度,η为电导率,E与电导率成反
学 比，所以低电导区就有了较高的电位梯度。这种高电位梯
实 5、Acr 10.0g
Bis 2.5g
验 6、蔗糖 40.0g
7、电极缓冲液Tris 6.0克；甘氨酸 28.8克；加水到1L 用时稀释10倍
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实验步骤
设计试验
生
一、样品的提取
物
化
学
二、PAGE电泳
实
验
三.结果分析
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（一）、样品的提取
设计试验
生 一、过氧化物同功酶的提取
泳中浓缩成层，因而具有良好的清晰度和分辨率。
按器材来分主要有垂直的圆盘电泳和板状电泳。
下面就三种物理效应的原理分别加以说明：
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1.样品浓缩效应 上述不连续系统中的三种
生 物
不连续使样品在浓缩胶中得到浓缩。 （1）凝胶孔径不连续性。在上述三层凝胶
中，样品胶及浓缩胶为大孔胶；分离胶为小孔
实
度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动。在快离子和 慢离子的移动速度相等的稳定状态建立之后，则在快离子
验 和慢离子之间形成一个稳定而又不断向阳极移动的界面。
由于蛋白质的有效迁移恰好介于快、慢离子之间,因此也就
聚集在这个移动的界面附近,被浓缩形成一个狭小的中间层。
由于浓缩胶为大孔胶, 对样品没有分子筛作用。
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2.分子筛效应: 分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通
过一定孔径分离胶时,受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移
率,这就是分子筛效应。蛋白质进入PH8.9的同一孔径的分离
生
胶后。此时,高电压消失,在均一的电压梯度下,由于甘氨酸解 离度增加，加之其分子量小,其有效泳动率增加,赶上并超过
化
胶。在电场作用下，蛋白质颗粒在大孔胶中泳
学 动遇到的阻力小，移动速度快，当进入小孔胶
实 时，受到的阻力加大，移动速度减慢，因而在
验 2层凝胶交界处，样品迁移受阻而压缩成很窄
的区带，并在此界面上依其电荷效多少依次排
列分开，通常可浓缩样品300倍。
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（2）缓冲体系离子成分及pH值的不连系性。在三层凝胶
甘氨酸解离度增加，其有效迁移率超过蛋白质；因此氯离子
及甘氨酸根沿着离子界面继续前进。蛋白质分子由于分子量
大，被留在后面，然后再分成多个区带。（如图）。
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（⑶电位梯度的不连续性。电位梯度的高低与电泳速
度的快慢有关（V=mE）,迁移率低的离子在高电位梯度中
因此各种蛋白质按电荷多少,分子量及形状(既荷质比q/r),以
一定顺序排成一个个区带。
PAGE连续体系应用也很广,但无浓缩效应, 利用分子筛
及电荷效应进行样品分离,条件温和,对生物活性的保持有益。
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学
pH6.8的凝胶缓冲体系中，甘氨酸解离度最小，仅有0.1—1%， 因而在电场中迁移很慢，称为慢离子。大多数蛋质pI在5.0左
实 右在pH6.8或pH8.9时均带负电荷向正极移动，其有效迁移率
验 介于快离子和慢离子之间，于是蛋白质就在快、慢离子形成
的界面处，被浓缩成为极窄的区带。当进入pH8.9的分离胶时，