项目名称+实验步骤
编号KB2016PRRSV-0201-DC

试验名称 感染性克隆突变体1
试验类型
预实验 对照试验产品研发试验替补试验 复核试验

目的意义
验证蓝耳N糖基化位点突变对抗原免疫原性的影响

研究内容 1.在pUC19-PRRSV载体上突变gene1的位点1 2.将突变好的片段双酶切，回收，连到pWSK载体上去

技术路线
人员安排
江雪梅
进度安排 pUC19-PRRSV突变体构建 2016年9月12-2016年9月14日
突变体测序，筛选 2016年9月18日-2016年9月22日
将突变体转移到pWSK载体上去 206年9月24日-2016年9月30日

试验材料
1. 质粒pUC19-PRRSV
2. 质粒pMD-19T-AP
3. 质粒pWSK-PRRSV
4. 引物F:CCggcgcgccagaaagggaaaatttataa
5. 引物R1:gactcacaCtccctatcccaaatatctcgggatgg
6. 引物F1:atagggaGtgtgagtcaagtttatgttgacatcaag
7. 引物R:gctgggaccatgccggccttaatt
8. 测序引物Fcx1：gcatgaccgatgtagtgagaacgat
9. 限制性内切酶AscⅠ、PacⅠ
10. T4连接酶
11. 大肠杆菌菌株：DH5α，BL21(DE3)

试验方法
1. 引物F、R1以质粒pUC19-PRRSV为模板，PCR扩增片段A（1126 bp）；F1、R以质粒pUC19-PRRSV
为模板，PCR扩增片段B（2411 bp）。
2. 引物F、R以片段A和片段B为模板，PCR扩增片段C（3521 bp）。
3. 用AscⅠ、PacⅠ双酶切片段C，胶回收基因片段C（3496 bp）；用AscⅠ、PacⅠ双酶切质粒
pMD-19T-AP（2702 bp+15 bp），胶回收载体片段（2702 bp）。
4. 将基因片段C（3496 bp）和载体片段（2702 bp）用T4连接酶连接，转化大肠杆菌D
H5α感
受态细胞。
5. 提取质粒与质粒pUC19-PRRSV比较大小（一样大），酶切鉴定后送测序，测序正确的质粒即
为重组质粒pUC19-突变体1。
6.
用AscⅠ、PacⅠ双酶切质粒pUC19-突变体1（3496 bp+2702 bp），胶回收3496 bp片段；用

AscⅠ、PacⅠ双酶切质粒pWSK-PRRSV（约5500 bp+3496 bp），胶回收约5500 bp片段。
7. 将3496 bp片段和约5500 bp片段用T4连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。
8. 筛选重组子，重组质粒即为感染性克隆突变体1。

结果汇总分析

结果复核检验

样品保存
样品编号 保存条件和数量

样品保存人 保存位置和日期
样品理论保存时间 样品详细备案
执行人/日期 复核人/日期
执行人/日期 复核人/日期
执行人/日期 复核人/日期
制卡人 发卡人
接卡人 执行人
收卡人 归档人
注：制卡人指方案制定人员；发卡人指对该流程卡终审确认签字人，两人签字有效；接卡人指项目主管或
助管；执行人指参与实验操作的人员；收卡人必须是部门主管或助管和发卡人共同签字；归档人由学术委
员会常务委员任命二人共同负责签字。
大项目命名原则：公司名称+时间+项目+发卡人（接卡人）名字首字母简称
如：KB2016PRRSV-DZS
子项目命名原则：公司名称+时间+项目+子项目代码+发卡人（接卡人）名字首字母简称
如：KB2016PRRSV-01-DZS
流程卡编号原则：公司名称+时间+项目+子项目代码+子项目中试验步骤+发卡人（接卡人）
名字首字母简称，如：KB2016PRRSV-0101-DZS

子项目代码需由方案初审通过后经统筹中心备案领取。