细胞骨架研究中常用药物
药物名称 作用
细胞松弛素B (cytochalasin B, CB)
结合在微丝的正端，阻抑其聚合， 同时提高临界浓度，最终导致微 丝的解聚
强烈亲和微丝，结合在微丝中 actin亚单位之间，稳定微丝、促 进微丝聚合 阻断微管蛋白组装成微管 促进微管的装配，稳定已形成的 微管
鬼笔环肽 (phalloidine) 秋水仙素（colchicine） 紫杉醇（taxol）
片被冲起后，再轻轻揭下盖玻片。
注意盖玻片的正反面
切勿产生气泡！
37℃预温 PEM洗数3次 避光操作
滴加10L Ho.33342复染色
荧光镜下观察
注意事项
注意不要弄碎盖片，分清细胞所在面； 各步洗细胞要轻，勿使细胞脱落； 荧光观察注意避光操作 节约试剂。
思考题
PEM缓冲液的作用是什么？ 0.5%Triton X-100处理细胞的作用是什么？ 鬼笔环肽用于细胞骨架研究的优缺点是什么？
•用小砂轮切去
长方形盖玻片的 一角作为标记以 便识别细胞面。
取出盖片，于小平皿中37℃预温 PEM洗3次(每次 1mL)
•细胞密度6080%
Triton X-100处理约10min(1mL) 37℃预温 PEM洗3次(每次 1mL) 37℃预温 4%多聚甲醛固定细胞15min (1mL) 37℃预温 PEM洗3次 55nM Alex -phalloidin 10L湿盒中室温 染色30min。 在parafilm 膜上加PEM ，待盖玻
蛋白和抗体的 FITC 494/518 绿色荧光 耦联探针
Texas red 595/615 红色荧 光
染死细胞,对PH值变化不敏感 多参量细胞标记 探针微偏碱性,可标记溶酶体等酸性细 胞器 可进入活细胞,阳离子性,摄入快,淬灭 快,无毒性
溶酶体 线粒体
Neutral red 541/640 红色 荧光 Rhodamine 123 507/529 黄绿色荧光
实验原理
鬼笔环肽(phalloidin) 是从一种毒性菇类中分离的剧毒 生物碱，它同细胞松弛素的作用相反, 只与聚合的微丝结 合, 而不与肌动蛋白单体分子结合。它同聚合的微丝结合 后, 抑制了微丝的解体, 因而破坏了微丝的聚合和解聚的 动态平衡。 由于鬼笔环肽非常特异地结合并稳定聚合态肌动蛋白, 因 而对肌动蛋白的动态平衡造成严重影响. 此外, 较高浓度 的鬼笔环肽对细胞有毒害作用. 因此, 用鬼笔环肽标记微 丝并不是用于研究活体细胞的理想方法.
细胞骨架组分的 荧光染色观察
实验目的 掌握细胞骨架的显示方法 掌握荧光显微镜的使用方法 了解荧光显微镜下细胞骨架的基本形态结构
背景知识
常用荧光探针介绍
细胞参量 DNA和RNA 荧光探针 吸收/发射 nm
Propidum iodide(PI) 535/617 红色荧光 Ethidium bromide(EB)518/605 红色荧光 DAPI 358/461 蓝色荧光
细胞骨架
狭义的细胞骨架指细胞质骨架，包括微丝、微管和中间纤维。 广义的细胞骨架包括细胞核骨架、细胞质骨架、细胞膜骨架 和细胞外基质。
微管
2014-11-17
ห้องสมุดไป่ตู้丝
2014-11-17
中间纤维
2014-11-17
背景知识

S.D.Pone 用考马斯亮蓝染人皮肤成纤维细胞的细胞骨 架获得成功。1982年上海植物生理所陈梓卿采用植物细胞 为材料也获成功。实践证明这是一种简单易行的方法。 当细胞用适当浓度的 triton X -100 溶液（聚乙二醇辛 基苯基醚，一种非离子去垢剂）处理，能够溶解质膜结构 中及细胞内许多蛋白质，而微丝束结合得比较紧密，不容 易被去除 ，经固定和染色后，可在光镜下观察到由微丝 组成的纤维束。
特性
嵌入核酸双链间,只能标记死细胞.用于 染色 体,细胞观察,分辨死活细胞和细胞周期研究 嵌入核酸双链间,只能标记死细胞.用于电泳 分析,染色体观察
半通透细胞,结合于DNA的AT碱基对.用于细 胞周期的研究,染色体和细胞核的观察
Hoechst33342 350/461 蓝 结合于DNA的AT碱基对,可进入活细胞,用于 细胞周期的研究,染色体和细胞核的观察 色荧光
ATP、 Mg2+、高K+、Na+
G-actin
Ca2+、低Na+、K+
F-actin
实验步骤
材料：
CHO（中国仓鼠卵巢细胞）、鸡胚成纤维细胞 试剂： 1.PEM ： 50mM pipes (pH6.9), 5mM EGTA, 5mM MgSO4, 0.225M 山梨醇 2.0.5% Triton X-100溶于PEM缓冲液中。 3.4%多聚甲醛溶于PEM缓冲液中。