细胞培养与细胞生物学常用技术目录实验一软琼脂克隆形成 (2)实验二细胞划痕愈合 (4)实验三细胞活力检测 (6)实验四细胞免疫荧光 (8)实验五细胞转染 (12)实验六细胞总RNA提取 (15)实验七逆转录反应 (18)实验八Real Ｔｉme PCＲ……………………………………………2０实验一软琼脂克隆形成【原理】正常情况下，贴壁生长的细胞必须依附在固体基质上才能生长,将其悬浮于液体或半固体基质中培养则难以增殖，这种现象称为锚定依赖性生长(anchorage dｅpｅnｄeｎｔｇrｏwｔh）。
而某些细胞在在被转化后,例如恶性肿瘤细胞，可以不依赖固体基质,在半固体(琼脂、甲基纤维素）培养基中也可增殖并形成细胞集落,这种现象称为锚定非依赖性生长(anｃhoｒage ｉndepｅnｄentｇrｏwtｈ)。
锚定非依赖性生长是肿瘤细胞的一种标识，也是检测恶性转化细胞较为准确的标志之一。
软琼脂克隆形成技术，则是在体外水平检测肿瘤细胞和转化细胞系锚定非依赖性生长能力最常用的手段之一。
该技术利用低熔点琼脂糖模拟体内细胞所处的半固体状态,并将细胞消化成单细胞,使细胞处于不贴壁及单细胞状态。
经过三周左右的生长，通过比较克隆形成率,来比较不同细胞或同一种细胞在不同的处理之后的转化及锚定非依赖生长的能力。
因此，软琼脂克隆形成实验是肿瘤研究领域一种重要的体外检测技术。
【材料】1、仪器：CＯ2培养箱、倒置显微镜、超净工作台、酒精灯、高压灭菌锅、水浴锅;2、试剂:ＤMEM培养基、胎牛血清、无水乙醇、75%乙醇、PBS 溶液、0.25%胰酶溶液、低熔点琼脂糖；3、细胞株:肝癌细胞系HepG２;【步骤】1、配制1．２%和0.7%的低熔点琼脂糖,高压灭菌后置于42℃水浴锅(或者恒温温箱）中，使其保持融化状态;2、配制2x DMEM培养基（含20%FＢS、2ｘ抗生素)，37℃预热；3、将1．２％的低熔点琼脂糖胶与2x DMED培养基等体积混合,将混合液加入到６孔板中，每孔１.５mL,轻轻混匀，避免产生气泡,室温放置待其凝固；4、取对数生长期的细胞,胰酶消化后尽量吹散细胞，制成单细胞悬液,取出１0μL,细胞悬液进行细胞计数,用无血清培养基稀释细胞至１x104个/ｍL;５、待下层胶完全凝固后,各取１.5mＬ的0.７%琼脂糖胶与２x 培养基进行等体积混合，加入300μL细胞悬液，充分混匀后入６孔板中，每孔1mL(即1００0个细胞／孔)，每种细胞设置３个平行孔;6、将６孔板置于CＯ２培养箱中孵育培养2-3周后，每孔加入１mＬ0.1％结晶紫染色，室温染色1０min，再用清水洗30ｍｉn,镜下拍照,计数并分析克隆形成情况。
实验二细胞划痕愈合【原理】细胞迁移是指细胞在接收到迁移信号或感受到某些物质的浓度梯度后而产生的移动。
细胞迁移是正常细胞的基本功能之一，是机体正常生长发育的生理过程，也是活细胞普遍存在的一种运动形式。
胚胎发育、血管生成、伤口愈合、免疫应答、炎症反应、动脉粥样硬化、癌症转移等过程中都涉及细胞迁移。
细胞划痕愈合实验(woｕｎd healing）简称划痕实验,是最早用来研究细胞迁移的体外实验,操作简单,经济实惠,因而被广泛应用。
细胞划痕愈合的操作过程十分简单,基本的步骤包括“划痕”的制造,细胞迁移期间图像的获得以及后期数据的处理。
具体过程为：当细胞长到融合成单层状态时，在融合的单层细胞上人为制造一个空白区域，称为“划痕”；然后置于显微镜下连续拍照，记录划痕边缘的细胞逐渐进入空白区域,即“划痕”愈合的过程，最后根据“划痕”愈合的速率反映细胞迁移的速率。
【材料】１、仪器:CＯ2培养箱、活细胞工作站、超净工作台、酒精灯;2、试剂及耗材：ＤMEM培养基、胎牛血清、75%乙醇、ＰBS溶液、0.２５%胰酶溶液、30mm直径细胞培养皿、尺子、记号笔;3、细胞株：肝癌细胞系HeｐG2;【步骤】１、培养皿接种细胞前,先用直尺测量,并在培养皿背面做“横线”标记,大约每隔０.５～1.0ｃｍ一条,一共５条线;2、取处于指数生长的细胞，胰酶消化后收集细胞沉淀,细胞计数后稀释至2.5x１0５个/mL；3、取背面做好标记的培养皿（直径３0ｍm)，每皿接种2mＬ细胞，置于培养箱培养3４h;4、取出细胞培养皿，用1０μＬ枪头比着直尺,垂直于底面的横线划痕；５、加入1mL PBS缓冲液,清洗细胞3次，洗去划痕产生的细胞碎片;6、加入2mL无血清培养基,置于活细胞工作站下拍照２4h，每小时拍一张照片；７、根据收集图片数据分析实验结果,计数细胞迁移率。
迁移率=【(Ｔ0时划痕宽度值-Tt时划痕宽度值）/T0时划痕宽度值】ｘ100%实验三细胞活力检测【原理】最常用的细胞活力检测方法为噻唑蓝比色法（ＭTT法）。
MTT全称为3-（4，５-Dｉmetｈylthiazol-2-yl）-２,5-dipheｎylｔｅtrａzｏｌｉuｍbroｍide,汉语化学名为3－(4,5-二甲基噻唑-２)-2,５-二苯基四氮唑溴盐,商品名为噻唑蓝，是一种黄颜色的染料。
活细胞线粒体内琥珀酸脱氢酶可以将外源性ＭＴＴ还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒，并沉积在细胞中,但死细胞没有此功能，因此结晶形成的量与活细胞数成正比。
ＤＭＳO能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在490ｎm波长处测定其光吸收值,可间接反应活细胞数量。
由于该方法灵敏度较高，而且相对比较经济,因此广泛应用于药物筛选等细胞毒性检测领域。
【材料】1、仪器:CO２培养箱、倒置显微镜、超净工作台、酒精灯、多功能酶标仪;2、试剂：细胞培养基、胎牛血清、MＴT（5ｍg／mＬ)、DMSO、７5%乙醇、PBS溶液、顺铂母液3、细胞株:肝癌细胞系HepG2；【步骤】一、细胞接种１、从ＣO2培养箱中取出细胞培养瓶，吸弃培养基，ＰBS洗涤2次，胰酶消化后,加入培养基重悬细胞并转移至离心管中;2、800rpm离心2ｍiｎ,弃上清;3、加入３～5ｍL新鲜培养基重悬细胞（以25cm2培养瓶为例)，吸取１0μL细胞悬液，滴加至血球计数板上进行细胞计数;4、根据细胞计数结果,将细胞浓度稀释至4ｘ104个/mL;5、将细胞悬液按100μL/孔加至96孔细胞培养板;6、将96孔板置于ＣO2培养箱中孵育培养过夜。
二、细胞荷药１、用新鲜培养基将５ｍM顺铂母液的药物浓度稀释至15μＭ;2、从CO2培养箱中取出96孔板,吸弃培养基，实验组更换为上述含药物的新鲜培养基，对照组更换为新鲜培养基；3、将9６孔板置于CO２培养箱中继续孵育培养24ｈ。
三、MTＴ法检测1、从CＯ２培养箱中取出96孔板，吸弃培养基，每孔加入90μＬ新鲜培养基及１0μL 5mg／mL ＭＴT；2、将9６孔板置于CO２培养箱中继续孵育培养4h；３、吸弃培养基,每孔加入100μL DMSO,震荡混匀１0miｎ;４、用酶标仪测定490nｍ处的吸光值（Ａ4９0），计算细胞活力。
实验四细胞免疫荧光【原理】免疫细胞化学(immunohiｓtochemｉstry),是利用抗原抗体间特异性结合的原理,同时借助特殊的标记技术，实现对细胞内目的抗原或抗体进行定位、定性或定量检测的一种技术。
它不仅特异性强、灵敏度高，而且克服了传统免疫学检测技术只能定性和定量，而不能定位的缺点，可以实现定性定量的同时对目的蛋白进行精确定位,因此又被称为原位免疫检测技术。
也正由于具备这些优势，免疫细胞化学技术已在免疫学、微生物学、病理学、肿瘤学以及临床检验等诸多领域中得以被广泛应用。
免疫细胞化学技术有多种染色方式,根据标记物的种类,分为免疫荧光法、免疫酶标法、免疫铁蛋白法及免疫胶体金发等。
其中，免疫荧光法结合激光共聚焦扫描显微镜拍照技术,大大提高了检测分辨率，可以更为精确地检测抗原的细胞定位及分布。
目前可选用的荧光素较多,其中较为成熟的荧光素标记物包括异硫氰酸荧光素(fluorescｅｉn iｓoｔhiocyanate,FITC)、四甲基异硫氰酸罗丹明(tetrａmeｔhyl rhodaｍiｎｉsoｔｈiocyａｎate，TRIＴＣ）、四乙基罗丹明（rｈoｄamine,RB200）等,更有利于实现同时对两种或多种抗原进行检测，即双染和多染技术。
另外,免疫荧光可以对活细胞进行染色，在流式细胞术(flowcytomitｒy，ＦCW)方面有更多的应用,因而成为最为常用的免疫细胞化学技术之一。
免疫荧光技术是先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，再用这种荧光抗体(或抗原)作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。
在细胞中形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素，受激发光的照射后，由低能态进入高能态,而高能态的电子是不稳定的，以辐射光量子的形式释放能量后,再回到原来的低能态的过程中可以发出明亮的荧光，利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织,从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术测定含量。
根据荧光素标记的位置,可以分为直接法与间接法。
直接法是最早的标记方法,是利用荧光素直接标记待测蛋白第一抗体的标记方法，这种方法特异性高，但灵敏度较低,而且每种抗体均需要单独标记，十分不便且成本相对较高，因此逐渐被其他方法所替代；间接法是对直接法的改进,它不再标记直接与抗原结合的特异性一抗，而是标记与一抗结合的二抗，由于与一抗结合的二抗分子往往不是一个，因此间接法可以大大提高检测的灵敏度,与直接法相比,荧光亮度可增强3-4倍。
除灵敏度高外，间接法所需要的种属间接荧光抗体，可以适用于同一种属产生的多种第一抗体的标记显示，大大降低了检测成本,因此成为现在最广泛应用的免疫荧光技术之一。
【材料】1、仪器:ＣO2培养箱、倒置显微镜、超净工作台、酒精灯、正置荧光显微镜、高压灭菌锅;2、试剂：DMEM培养基、胎牛血清、无水乙醇、7５%乙醇、ＰBS溶液、0.２5％胰酶溶液、4%多聚甲醛、Ｐ53一抗、FITC荧光二抗、抗荧光衰减封片剂、TrｉtｏｎX-10０;3、细胞株:肝癌细胞系HepG2;【步骤】一、准备工作1、切片处理:将盖玻片置于浓酸浸泡过夜,自来水冲洗２０遍，蒸馏水清洗5遍,高压灭菌，烘干备用;2、细胞悬液制备:胰酶消化HepＧ2细胞，收集细胞沉淀,培养基重悬,制成单细胞悬液，计数后稀释至2x10５个/mＬ备用。
二、细胞爬片1、在6孔板孔中央滴加100μＬ培养基，每孔放入一张经过处理的盖玻片，使其恰好覆盖在孔内培养基上；2、每孔缓慢逐滴加入2mL稀释后的细胞悬液，轻柔混匀;3、将6孔板置于ＣO2孵箱中,培养过夜。
三、免疫荧光1、取出6孔板,弃掉孔内培养基，PBS轻柔清洗3次，每次3mｉn;2、每孔加入1ｍＬ预冷的４%多聚甲醛,4℃固定20mｉn;３、ＰＢS清洗3次，每次３ｍin;4、每孔加入1mL含0.２%Ｔrｉtｏn Ｘ-100的ＰBS,冰上静置１０min；5、PＢＳ清洗3次，每次3miｎ;6、每孔加入1ｍL含1%BSA的PBS,室温封闭1ｈ；7、将P53一抗以１:1０0的比例稀释后，取出100μL滴加在封口膜上,从培养孔中取出盖玻片，用吸水纸吸去背面及细胞面边缘处的液体后,轻轻放在封口膜上，细胞面与抗体均匀接触，４℃孵育过夜;8、取下盖玻片，置于6孔板相应孔中,PＢS清洗３次,每次3mi ｎ;9、滴加荧光素二抗,37℃孵育30mｉn（注意避光操作)；10、ＰBS清洗3次,每次3miｎ;11、每孔加入50０μL ＤＡPI染色液,室温染色５mｉn；1２、PＢS清洗３次,每次３ｍin;13、取一张洁净载玻片,中心位置滴加５0μL抗荧光淬灭封片剂，从6孔板中取出盖玻片，控干液体,贴有细胞的一面朝下，放置在封片液上，尽量避免气泡;14、显微镜下观察、拍照。