2、发酵条件的控制
（1）pH值的控制
培养基的pH必须控制在一定的范围内，以满足不同类型微生物的生 长繁殖或产生代谢产物。为了维持培养基pH的相对恒定，通常在培 养基中加入pH缓冲剂，或在进行工业发酵时补加酸、碱。 通常培养条件： 细菌与放线菌：中性或碱性范围（pH6.5～8.0） 酵母菌和霉菌：偏酸性(pH4～6)

寻找酶要依据微生物的生境
不同环境中的微生物具有与各自生理特征和代谢类型相对应的独 特的酶；

产酶微生物的发现通常包括分离和筛选两个环节。
分离是通过分离技术将目标微生物从其生存的各种环境中分离出来；
筛选是以性能为目标确定合适的菌株。
3.3.1 常规酶筛选的一般策略


依据酶促反应过程和目标产物确定所需要的酶；
绿色植物 （自养）
二氧化碳 无机氮化物 利用日光能 不需要 无机盐 水
培养基的设计原则
1、选择适宜的营养物质 2、营养物的浓度及配比合适 3、物理、化学条件适宜 4、经济节约 5、精心设计、试验比较



培养不同的微生物必须采用不同的培养条件； 培养目的不同，原料的选择和配比不同；
不同阶段，培养条件也有所差异。
葡萄糖异构酶
米苏里游动放线菌、二球状节杆菌、凝结 芽孢杆菌、树枝状黄杆菌、橄榄色产色链 霉菌、白色链霉菌、鼠灰色链霉菌、锈赤 色链霉菌
目前主要商品酶制剂及其来源
葡萄糖氧化酶
黑曲霉、生机青霉、尼崎青霉
半纤维素酶
橙皮苷酶 菊粉酶
黑曲霉
黑曲霉 假丝酵母、曲霉属
脂肪酶
黑曲霉、米曲霉、圆柱状假丝酵母、根毛 霉、无根毛霉、小球菌、类地青霉、胰脏、 山羊舌腺等

四、酶的发酵工艺条件与控制
1、培养基
各种生物对营养的需求
动物 （异养） 碳源 氮源 能源 生长因子 无机元素 水分
糖类、脂肪 蛋白质及其降解物 与碳源同 维生素 无机盐 水
微生物
异养 糖、醇、有机酸等 蛋白质及其降解 物、有机氮化物、 无机氮化物、氮 与碳源同 有些需要维生素等 生长因子 无机盐 水 自养 二氧化碳、碳酸盐等 无机氮化物、氮 氧化无机物或利用日 光能 不需要 无机盐 水
碳源
构成细胞物质或代谢产物中碳架 碳源可作能源，为生命活动提供能量 常用碳源：糖类、醇类、脂类、有机酸、烃类、蛋白 质及其降解物 异养微生物：糖类是最好碳源（葡萄糖最为通用） 选择合适碳源，以适应目的酶的合成调节机制
氮源
构成细胞物质和代谢产物中氮素（不能用作能源 ） 氮源
有机氮源
无机氮源
蛋白胨、酵母膏、牛肉膏
橄榄色链霉菌(St.olivaceus)
葡萄糖异构酶
葡萄糖异构酶
二、 产酶菌种的保藏
1）低温保藏
2）干燥保藏
3）产酶菌种的退化与活化复壮
四、菌种的培养

固体培养法：以麸皮、稻草、米糠等农副产品作为 营养源，加少量水，使之呈固体形式的培养基，接 种，并在合适的温度下培养，使其生产并形成酶。 液体培养法：用三角瓶装适当的液体培养基，在摇 床振荡一定时间。
由葡萄糖制果糖
皮革脱毛
分解支链淀粉，支点的а-1，6- 10016 葡萄糖苷键，产物为直链淀粉 与糊精，与β-淀粉酶协同作用， 能降低β-界限糊精，显著提高β淀粉酶酶解程度
目前工业用主要酶的生产菌来源
微生物 类别 菌 名 产生 的酶 用途 所用菌号分离筛选 来源
AS3.3871,自北京 土壤分离得到

从自然界发现产酶微生物
一般按采样、富集、分离与初复筛等几个步骤；

产酶微生物及酶的高通量筛选。
单克隆菌落在平板上的固定、培养以及液体几种的自动化技术可以一
周筛选1000以上各菌落。
3.5 菌种选育

自然选育
自然环境或微生物自身代谢产生的诱变物质；

诱变选育
1）营养缺陷型突变株
2）抗反馈阻遏和抗反馈抑制突变株
一般产酶微生物的筛选原则：




发酵周期短,产酶量高； 微生物尽可能地利用便宜和方便的原料生产酶； 所产酶最好具有比较高的专一性，没有或很少有生产副产 物的杂酶； 所用微生物是不产生有害物质的非致病性的安全微生物； 微生物的遗传稳定性高。 由非致病微生物制取的酶,需作短期毒性实验。 非常见微生物制取的酶,需做广泛的毒性实验,包括慢性中 毒实验。
第三章 微生物发酵产酶
第一节 产酶微生物的发现及筛选
3.1 酶的来源与多样性：

80%以上的新酶来源于微生物，动物与植物 来源的只占8%和4%。 微生物的多样性与丰富的资源促成了酶的多 样性。 筛选微生物及其酶仍是目前发现新酶的有效 和主导的方法，特别是新酶发现的初期。


获取酶源的方式：

（1）生产菌可从菌种保藏机构和有关研究部门获得 菌种保藏机构 网址 美国模式培养物保藏所（ATCC） 德国微生物和细胞生产收藏中心（DSMZ）www.gbt.cle/DSMZ 中国微生物信息网 微生物菌种数据网(MSDN) .br/bdt/msdn 世界微生物数据中心(日本) wdcm.nig.ac.jp 大肠杆菌遗传收藏中心(CGSC) cgsc.biology.yale.edn/top.html （2）自然界是产酶菌种的主要来源 要获得生产某种酶的菌种可从富含该酶作用底物的场所去采集菌种样品。



调节pH的方法：
（1）调节培养基的原始pH，保持一定的C/N比；
（2）添加缓冲液，保持pH一定范围；
（3）调节通风量，使氧化还原电位保持一定的值； （4）发酵液pH高用糖或淀粉调节，过低通过氮调节。
细胞发酵产酶的最适pH值与生长最适pH值往往有所不同。 ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ胞生产某种酶的最适pH值通常接近于该酶催化反应的 最适pH值。 有些细胞可以同时产生若干种酶，在生产过程中，通过 控制培养基的pH值，往往可以改变各种酶之间的产量 比例。例如，采用米曲霉发酵生产蛋白酶时，当培养基 的pH值为碱性时，主要生产碱性蛋白酶；培养基的pH 值为中性时， 主要生产中性蛋白酶；而在酸性的条件 下，则以生产酸性蛋白酶为主。

采用中间微生物宿主表达生产极端酶的时候，需要在类似 极端微生物生长的生境下才可以得到折叠成天然构型的酶。

极端微生物产培养基成分要接近生境。
3.3.3 不可培养微生物中酶的发现策略

不可培养微生物是地球上最大的尚未开发的自然资源； 采用分子筛选，从元基因组中筛选酶基因，然后克隆， 表达。
3.4 微生物和酶的一般筛选方法
（2）温度的控制
枯草杆菌的最适生长 温度为34～37℃ 黑曲霉的最适生长温 度为28～32 ℃
通常在生物学范围内每升高10℃，生长速度就加快一倍， 所以温度直接影响酶反应，对于微生物来说，温度直接影 响其生长和合成酶。
植物细胞生长的最适pH值为5～6
pH值对产酶的影响

在发酵过程中，微生物不断进行着各种代谢反应，代谢产物能直接影 响着pH值。培养基成分中C/N比高，发酵液倾向于酸性； C/N比低， 发酵液倾向于碱性。
通气量的影响：通气量足，糖、脂类物质能完全氧化，最后产物为 CO2和H2O；通气量不足，糖、脂类物质氧化不完全，则会生产中间 产物有机酸。 盐利用的影响：强酸类盐的利用会引起pH值下降，强碱类盐的利用 会引起pH值的上升。 碳源不足时，也会因利用氨基酸的碳架而引起pH值的变化。

3.2 微生物产酶的优点：

种类多、酶种丰富，而且菌株容易诱变，菌种多样； 生长繁殖快，容易提取酶，特别是胞外酶； 培养基来源广泛、价格便宜； 可以在线监控酶发酵生产过程，实现连续化、自动化， 经济效益高；

可利用基因工程手段，选育菌种、增加酶产量和开发新 菌种。
3.3 微生物酶的筛选策略
实验室的常用培养基：
细菌： 牛肉膏蛋白胨培养基（或简称普通肉汤培养基）； 放线菌：高氏1号合成培养基培养； 酵母菌：麦芽汁培养基； 霉菌： 查氏合成培养基；
例如枯草芽孢杆菌： 一般培养：肉汤培养基或LB培养基； 自然转化：基础培养基； 观察芽孢：生孢子培养基； 产蛋白酶：以玉米粉、黄豆饼粉为主的产酶培养基；
黑曲霉（A.mger)
米曲霉(A.oryzae)
米根霉(Rh.oryzae)
雪白根霉(Rh.niveus) 紫红被包霉(Morterella vinaceae) 粟疫霉(Endothia parasitica) 微小毛霉(M.pusillus)
а-淀粉酶、糖化酶、、果胶酶、
糖化酶 蜜二糖酶 凝乳酶 凝乳酶
寻找具有这种催化活性的酶或微生物；
1）从商品酶库中筛选，如Sigma、Novo Nordisk等，最快、最简 单，但品种有限； 2）从保藏微生物菌株中筛选，如CGMCC、ATCC、UKNCC等，此 外，可从一些公开的微生物数据库查阅有关酶源信息，如MINE、 MSDN、世界微生物数据中心等； 3）自然界发现和筛选产酶微生物，注意采样环境； 4）从基因克隆库中筛选。
3）组成型突变株，解除对诱导物的依赖 4）抗性突变株，特别是抗噬菌体菌株
第二节 微生物酶的发酵生产
一、优良的产酶微生物具备的条件：
（1）酶的产量高； （2）产酶稳定性好； （3）容易培养和管理； （4）利于酶的分离纯化； （5）安全可靠、无毒性等。
目前主要商品酶制剂及其来源
纤维素酶 右旋糖苷酶 а-半乳糖苷酶 β-葡聚糖酶 糖化酶 木霉（主要是里氏木霉）、绳状木霉 淡紫青霉、绳状青霉、毛壳霉 葡萄色被孢霉、黑曲霉、米曲霉、假丝酵 母、乳酸杆菌等芽孢杆菌 黑曲霉、曲霉属、枯草杆菌、青霉 黑曲霉、米曲霉、泡盛曲霉、根霉
铵盐、硝酸盐
需要注意合适的碳氮比
无机盐
参与酶的组成、构成酶活性基、激活酶活性 维持细胞结构的稳定性 调节细胞渗透压 控制细胞的氧化还原电位 有时可作某些微生物生长的能源物质 常用：硫酸盐、 磷酸盐、氯化物 以及含有钾、钠、 钙、镁、铁等元 素的化合物。