探针种类
重复DNA序列 序列 重复 单拷贝或低拷贝的DNA序列 序列 单拷贝或低拷贝的 基因组DNA 基因组
重复DNA序列探针 序列探针 重复
重复DNA序列、多基因家族作为探针与染色体原 序列、 重复 序列 位杂交。容易产生较高的分辨率。因为这些 位杂交。容易产生较高的分辨率。因为这些DNA 多拷则序列在染色体上可达几十个kb或几个 。 多拷则序列在染色体上可达几十个 或几个Mb。 或几个 日前所使用的这类探针有45S rDNA,5S rDNA、 日前所使用的这类探针有 、 着丝点序列、 序列、亚端粒序列、转座子等。 着丝点序列、端粒 序列、亚端粒序列、转座子等。
单拷贝或低拷贝DNA探针 探针 单拷贝或低拷贝
这类探针包括某个基因的DNA克隆 RFLP 克隆. 这类探针包括某个基因的 克隆 标记。 或RAPD标记。这些探针 标记 这些探针DNA序列一般只 序列一般只 有1-2kb.因而这类标记的原位杂交存在几个 因而这类标记的原位杂交存在几个 方面的困难: 方面的困难 1)需要用多层抗体结合来放大杂交信号 需要用多层抗体结合来放大杂交信号 2)杂交信号很弱时 难以与背景信号区分 杂交信号很弱时.难以与背景信号区分 杂交信号很弱时 3)能够显示杂交信号的细胞比例很低 能够显示杂交信号的细胞比例很低
4、样本的预处理
固定 洗涤 酶解：RNA酶，蛋白酶K 变性
5、杂交
恒温：37摄氏度 恒湿 避光 杂交信号的放大：二级放大
6、染色体显带 、
根据探针标记的荧光素颜色选PI （红）或 DAPI（蓝）显色 封片
7、荧光显微镜检测 、
避光 快速 注意淬灭时间
The end
基因组DNA探针 探针 基因组
利用不同基因组DNA同源性程度的差异。在原位 同源性程度的差异。 利用不同基因组 同源性程度的差异 杂交中只标记某一基因组或某个物种的基因组 DNA。 。 在杂交中标记的基因组DNA首先与其完全同源的 首先与其完全同源的 在杂交中标记的基因组 DNA杂交。 杂交。 杂交 可以检测出导入异源多倍体的外源染色体或染色 体片段， 体片段，同时可以清楚地显示出易位与交换的位 置。
五、FISH技术的应用 技术的应用
重复序列或多拷贝的基因家族的染色体定 位 杂种亲本染色体的鉴定 染色体的结构分析 异源染色质的鉴定 染色体物理图谱的构建
六、实验步骤
FISH样本的制备 探针的制备 探针标记 样本的预处理 杂交 染色体显带 荧光显微镜检测 结果分析。
七、实验流程
1、FISH样本的制备 、 样本的制备
荧光原位杂交类型
荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization, FISH)是20世纪80年代末在己有的放 射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射 性DNA分子原位杂交技术。 基因组原位杂交（GISH） 荧光原位杂交（FISH） 多色荧光原位杂交（M-FISH ）
染色体制片 相差显微镜 白片，不能染色
2、探针的制备 、
用生物工程技术获取特异的cDNA片段 从mDNA 分子与载体（质粒）DNA在体外重组 cDNA DNA 质粒转化 质粒扩增 质粒抽提、酶切、纯化→得到特异的cDNA探针
优 点
1、安全、可靠； 2、探针稳定，一次标记后可在两年内使用； 3、实验周期短、能迅速得到结果、特异性好、定 位准确； 4、FISH可定位长度在1kb的DNA序列，其灵敏度 接近放射性探针； 5、多色FISH通过在同一个核中显示不同的颜色可 同时检测多种序列； 6、既可以在玻片上显示中期染色体数量或结构的 变化，也可以在悬液中显示间期染色体DNA的结构。
二、原位杂交的基本原理
核酸分子杂交的基本原理是利用核酸分子 (DNA, RNA)的碱基对形成氢键的互补性 (A=T, A=U, C=G)，用一标记的核酸探针去 检测与之碱基互补的靶核酸 免疫学中抗原－抗体的反应。
三、原位杂交的分类
按杂交对象： 组织 细胞 染色体
按探针标记物
同位素（ 同位素（放射性）标记探针 标记探针 非同位素标记探针 荧光标记：最常用的为生物素、地高辛 (Digxigenin , DIG)、罗丹明（Rhodamine）、 荧光素（Fluorescence）、PI 、DAPI 酶标：如辣根过氧化酶(HRP)和碱性磷酸酶 (ALP)等。
3、探针标记 、
切口移位法，亦称缺口平移法，是常用的标记 DNA的方法。常为同位素标记，也可用地高辛和 生物素进行标记。 引物延伸法(primer extension)此法产量低，可标 记纯度不太高的DNA。 末端标记法(end - labeling) 分为5’末端和3’末端 标记。此法适用于合成的寡核苷酸探针。 体外转录法，此法应用于制备RNA探针。
荧光原位杂交技术 FISH
一、 概念
原位杂交( 原位杂交 in situ hybridization, ISH )是应用生物 化学中核酸分子杂交的原理,在组织切片、细胞涂 片或印片上原位检测某种DNA或RNA序列的一项 DNA RNA 技术。 1969年美国耶鲁大学Gall等首先通过基因探针将 核糖体基因在爪蟾卵母细胞上进行定位。
缺 点
实验条件要求严谨 信号淬灭快 对环境有一定污染
四、探针(probe) 探针
是含有互补顺序的外源性被标记的DNA或RNA片 段，是在原位杂交中用于检测细胞内特定DNA或 RNA顺序定位的特殊试剂 探针的碱的探针有不同种类，可用于不同靶 核酸的探测。