第四章 基因工程制药
第31页，共97页
二 基因工程菌常用的培养方式
分批培养（batch
culture）；
补料分批培养（fed
batch culture）； 连续培养（continuous culture）； 透析培养（dialysis culture）； 固定化培养（immobilized culture）。
第四章 基因工程制药（二）
基因工程菌的稳定性； 基因工程菌生长代谢的特点；
基因工程菌中试（看课本自学）；
基因工程菌发酵；
基因工程药物的分离纯化；
基因工程药物的质量控制。
第六节 基因工程菌的稳定性
遗传不稳定性的表现；
遗传不稳定性的的产生机制
； 影响基因工程菌稳定性的因素； 提高质粒稳定性的方法； 质粒稳定性的分析方法 ；

第四章 基因工程制药
第12页，共97页
质粒稳定性的分析方法

分裂稳定性：
平板稀释计数； 平板点种法。

结构稳定性：
单菌落中提取质粒，酶切后凝胶电泳或测序；
单菌落进行目标产物的表达分析，检测表达单元
的DNA。
第四章 基因工程制药
第13页，共97页
平板稀释计数法
基因工程菌 选择性培养液
第四章 基因工程制药
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菌体生长的调控
主要有两种观点：
能量决定最大比生长速率； 小分子前体和催化组分等决定最大比生长速率。
第四章 基因工程制药
第18页，共97页
菌体生长与能量的关系
能量（生长）>能量（有氧代谢），产生
代谢副产物乙酸；

有报道，乙酸浓度达到15g/L时菌体生长 停止； 乙酸的抑制与pH有关，适当提高pH能减 少乙酸的抑制。
菌体生长与能量的关系；
菌体生长与前体供应的关系。
第四章 基因工程制药
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菌体生长的表示方法
通常用比生长速率来表示； 比生长速率μ
：每小时单位质量的菌体所增加 的菌体量称为菌体比生长速率。它是表征微 生物生长速率的一个参数，也是发酵动力学 中的一个重要参数。其大小为0.693除以倍增 时间td（菌体量倍增）。
营养缺陷互补和抗生素抗性；
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连续培养
以一定稀释率进行不间断培养；
基因工程菌的不稳定性—连续培养困难； 解决办法：生长阶段和基因表达阶段分开，
两阶段连续培养，第一阶段质粒稳定，第二 阶段获得最高表达水平或最大产率。
关键的控制参数：诱导水平、稀释率和细胞
比生长速率。
第四章 基因工程制药
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补料分批培养
培养一段时间后，间歇或连续补加新
鲜培养基；
根据生长规律，通常控制溶氧和流加
补料结合。
第四章 基因工程制药
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透析培养


原理：利用膜的半透性 使培养物和培养基分离；
目的：去除代谢产物如 乙酸等对工程菌生长和 外源基因表达的影响；


膜、透析液、时间等；
E.coli—青霉素酰化酶 （11倍）。
第四章 基因工程基因工程菌的稳定性至少应在25代以上。
不稳定性两种表现形式：
质粒结构不稳定：重组 DNA 分子某一区域缺
失、重排、修饰，表观生物学功能丧失； 质粒分裂不稳定：分裂时出现一定比例不含 质粒的子代菌；
遗传不稳定性的的产生机制

第四章 基因工程制药
第36页，共97页
固定化培养
基因工程菌培养的一大难题：维持质粒的稳
定性。
固定化技术应用：固定化后，质粒的稳定性
大大提高，便于连续培养，特别是对分泌型 菌更为有利。
第四章 基因工程制药
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三 基因工程菌的发酵工艺
与传统的微生物发酵工艺的区别：
生物材料方面：基因工程菌带外源重组载体；
第四章 基因工程制药
第32页，共97页
分批培养
DO-Stat方法：
DO控制在20％（搅拌转速、通气速率）；
Balanced
DO-Stat方法：
乙酸维持在低浓度（DO、搅拌转速、糖的流
加速率）； 糖的流加速率和DO的平衡。
控制菌体比生长速率：
葡萄糖流速； 搅拌转速。
第四章 基因工程制药
生产目的方面： 基因工程菌生产的目的是使外源基因高效表达，
尽可能减少宿主细胞本身蛋白的污染。
基因工程菌发酵对营养要素和环境条件的需
求与宿主菌有共性之处，但也有特殊的需求。 特殊需求往往比共性需求更重要，更难满足， 经常是制约产业化的重要因素。
第四章 基因工程制药
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四 培养基组成与控制
一般，复合培养基营养较丰富，质粒稳定性
一般高于合成培养基； 但对于酵母，极限培养基比丰富培养基更有 利于维持质粒的稳定性；
比生长速率和限制性基质：
含有pBR325的E.coliGM31和GY2345： 用葡萄糖培养时，低比生长速率更容易丢失
质粒； 用氯化铵培养时，高比生长速率更容易丢失 质粒。
第四章 基因工程制药
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第八节 基因工程菌中试
看课本自学。
第四章 基因工程制药
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第九节 基因工程菌发酵
基因工程菌的培养过程；
基因工程菌常用的培养方式；
基因工程菌的发酵工艺；
培养基组成与控制；
培养工艺与控制； 其他因素对基因工程菌发酵的影响； 基因工程菌的培养设备； 高密度发酵。

基因工程菌质粒的表达需与宿主细胞竞争共同
的前体和催化结构，致工程菌生长速率降低 （工程菌的比生长速率往往低于其宿主细胞，特
别是工程菌诱导后）。
第四章 基因工程制药
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证据：在基础培养基中加入氨基酸（小分子
前体）能使菌体比生长率提高，蛋白合成增 加； 质粒存在对菌体代谢的影响（自学，P32）。
第四章 基因工程制药
第4页，共97页
影响基因工程菌稳定性的因素
遗传特性：
宿主；
载体；
外源基因是否整合到宿主染色体上。
发酵工艺：比生长速率
培养基（生长速率、限制性基质）； 温度、pH 值和溶氧；
培养操作方式；
第四章 基因工程制药
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培养基（2－1）
培养基的营养：
第四章 基因工程制药
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糖原
1-磷酸葡萄糖
a
6-磷酸葡萄糖 b
葡萄糖
6-磷酸果糖
1
果糖
1，6-二磷酸果糖
3-磷酸甘油醛
2 3
磷酸二羟丙酮
丙酮酸
3-磷酸甘油酸磷酸
3-磷酸甘油酸
磷酸烯醇式丙酮酸
第四章 基因工程制药
4
2-磷酸甘油酸
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第四章 基因工程制药
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第四章 基因工程制药
第10页，共97页
培养方式
分批：相对稳定； 连续：特别是在非选择性培养基中，
质粒很不稳定；
第四章 基因工程制药
第11页，共97页
提高质粒稳定性的方法
施加选择压力（分裂不稳定有效，生产不可取）: 抗药性标记：抗生素； 营养缺陷型标记：营养组份。 分阶段控制培养： 菌体生长阶段（阻遏）； 菌体达到一定浓度（诱导和去阻遏）。 控制培养条件：培养基，T，pH，DO，有害代 谢物；(基因工程菌反应慢) 固定化。
对数生长期
选择性培养基
繁殖一定代数
非选择性培养液
涂布
非选择性培养 基
第四章 基因工程制药
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平板点种法
长出菌落 基因工程菌 非选择性培养基 统计菌落数 选择性培养基 （含抗性标记） 计算稳定率
第四章 基因工程制药
第15页，共97页
第七节 基因工程菌生长代谢的特点
菌体生长的表示方法； 菌体生长的调控；
培养基中添加酵母提取物和谷氨酸等有利于
提高质粒稳定性。
第四章 基因工程制药
第7页，共97页
温度
大多数基因工程菌，在一定温度范围内，随
着温度升高，质粒稳定性下降； E.coli：
生长最适温度：37℃； 质粒稳定性最好的温度：30℃； 温敏启动子控制的质粒：42℃诱导外源基因的

低浓度—细菌生长； 高浓度目的蛋白不表达； 一般起始浓度0.015mol/L左右。
其他：维生素、生物素、营养物质（营养缺
陷型菌株）等。
第四章 基因工程制药
第42页，共97页
选择剂（selective agent）

维持工程菌的纯正性和质粒的稳定性的化合物； 目的：质粒的稳定性，根据质粒上的营养缺陷或 选择性标记基因，添加或缺陷选择剂； 选择剂种类：
第四章 基因工程制药
第19页，共97页
葡萄糖通过糖酵解产生的丙酮酸，在有氧条
件下，将进入三羧酸循环进行完全氧化，生 成H2O 和CO2，并释放出大量能量； 第一 阶段：（丙酮酸由胞液进入线粒体后） 丙酮酸的氧化脱羧（丙酮酸 乙酰CoA）；

第二阶段：三羧酸循环（乙酰CoA H2O 和CO2，释放出能量）。
表达（经常伴随质粒丢失）。
第四章 基因工程制药
第8页，共97页
pH值
例如：基因工程酵母表达乙肝表面抗原的
质粒：
pH为6.0时，质粒最稳定； pH为5.0时，质粒最不稳定；
第四章 基因工程制药