第二章基因工程制药part2
•大肠杆菌表达系统研究的发展趋势
•大肠杆菌表面表达技术的建立 •膜蛋白基因在大肠杆菌中表达的技术逐渐成为研究的热点 •领域，膜蛋白表达技术的发展促进了大肠杆菌表面技术的 •建立。 •外源蛋白质在菌体表面表达的优点是大肠杆菌可直接用于 •制备疫苗，进行生物催化和作为探针筛选药物。在一定程 •度上能与噬菌体展示系统相媲美。
• ATG与SD序列之间的碱基组成为A、T碱基丰富时，
mRNA翻译效率较高。
第二章基因工程制药part2
•表达质粒的优化和设计
• 核糖体结合位点本身和附近的序列决定了目标基因 mRNA 5’端的二级结构，研究表明mRNA 5‘端形成的 “茎环”结构阻碍了mRNA与核糖体30S亚基的结合， 从而抑制了翻译的起始。 • 尽量提高核糖体结合位点本身和附近的序列中A/T 碱基的含量，降低mRNA 5’端形成的“茎环”结构的可 能性，也是构建表达质粒时需要注意的事项。 •
采用较弱的启动子或部分诱导强启动子的方法可降 低蛋白质合成的速率，从而达到增加正确折叠重组蛋白质 的目的。
第二章基因工程制药part2
•大肠杆菌表达系统研究的发展趋势
改造信号肽的序列和结构，提高分泌效率
• 比较成功的例子是发现了把碱性磷酸酯酶基因phoA信 •号肽的疏水区置换为多聚Leu残基能明显提高分泌效率。 表 •明信号肽核心部位疏水性的增强有利于它与细胞膜的相互 作用。这一结果为天然信号肽优化改造的设计提供了很好 参考依据。
•
大肠杆菌高密度发酵时大规模制备蛋白质过程中
不
• 可缺少的工艺步骤。其目的是在单个菌体对目标基因
的
• 表达水平基本不变的前提下，通过单位体积的菌体数
量
• 的成倍增加来实现总表达量的提高。
•
目前常用的发酵方式有：恒定培养、流加补料培
养
第二章基因工程制药part2
•高密度发酵和工程化宿主细胞
•构建出产乙酸能力低的工程化宿主菌
•高密度发酵和工程化宿主细胞
•
利用透明颤菌血红蛋白能提高大肠杆菌在贫氧条
件
• 下对氧的利用率的生物学性质，把透明颤菌血红蛋白
基
• 因vgb 导入大肠杆菌细胞内以增加其对溶氧的宽容度。
• 从而降低菌体产生乙酸所要求的溶氧饱和度阀值。
•
用基因敲出技术缺失大肠杆菌的磷酸乙酰酶基因
• pta1和乙酸激酶基因ackA，使从丙酮酸到乙酸的合途
• 慢，使高密度发酵比较困难。
• 融合表达使目标蛋白的构象与天然状态不一样，导致
• 生物比活力降低，甚至没有活性。
• 融合蛋白和串联聚合蛋白需要用酶或化学切割出单体
• 目标蛋白。酶法成本比较高且加入的酶蛋白还必须分
离去除。化学法比酶法成本低，但不少裂解试剂有毒性。
第二章基因工程制药part2
•高密度发酵和工程化宿主细胞
第二章基因工程制药part2
•大肠杆菌表达系统研究的发展趋势
•共表达与蛋白质折叠过程密切相关的分子伴侣 •包涵体是由于在新合成的大量目标蛋白质的折叠过程中， •大肠杆菌细胞内参与折叠的蛋白质因子的量不能满足需要， •无法形成正确的构象而产生的，因此在大肠杆菌内共表达 •与蛋白质折叠过程密切相关的分子伴侣，折叠酶或硫氧化 •蛋白基因可以使目标基因可溶性表达的比例明显上升。
•研究表明这种作用是具有专一性的，不同的目标蛋白需要
•不同类型的蛋白因子共表达。在有些情况下需要多个蛋白
•因子共表达才能达到预期的目标。
第二章基因工程制药part2
•大肠杆菌表达系统研究的发展趋势
•共表达人或小鼠的二硫键异构酶、促进二硫键形成和正确折叠
•大肠杆菌周质空间通过二硫键形成酶DsbA 和 DsbB二个 •蛋白维持适当的氧化还原态势使蛋白质的二硫键形成。
径
• 被阻断。
•
改变代谢流的方向，通过共转化把枯草杆菌、酿
酒 第二章基因工程制药part2
•高密度发酵和工程化宿主细胞
•构建蛋白质水解酶活力低的工程化宿主菌
•
对于以可溶性或分泌形式表达的目标蛋白而言，随后
发
• 酵后期各种蛋白酶的累积，目标蛋白会遭到蛋白水解酶的
作
• 用而被降解。为了使对蛋白酶比较敏感的目标蛋白也能获
进行改造。 6. 在较低的温度下培养菌体和优化发酵条件。
第二章基因工程制药part2
•
但必须指出的是，由于目标蛋白本身的性质和用途
的
• 不同，上述几种方法在使用上是受到一定的限制的。主
要
• 表现为：
• 大肠杆菌对分子量较大的目标蛋白的转运和分泌效率
• 一般比较低，不能满足大规模制备的需要。
• 蛋白水解酶含量低的菌株往往代谢不旺盛，生长速度
第二章基因工程制药part2
•大肠杆菌表达系统研究的发展趋势
•大肠杆菌表面表达技术的建立
•主要通过三条途径是目标蛋白呈现在菌体表面： 把外源序列插入LamB、OmpA、PhoE等外膜蛋白的膜外区 把外源蛋白导入大肠杆菌鞭毛或伞毛的结构 这二种方法适合表达一段长度小于100个氨基酸残基的 外源序列，因为较大的外源序列的插入往往会使外膜蛋白不 能形成原来的三维结构，影响它转运过程和在膜上的定位。 在脂蛋白、lgA蛋白酶、ompA基因的N端或C端融合外源基 因 这种融合表达的方法对外源基因的限制条件就比较小， 其序列可在50到500氨基酸残基长度范围内。
第二章基因工程制药part2
•表达质粒的优化和设计
• 在构建表达质粒时，充分利用各个基因的结构特 征和特点，注意引入翻译增强子序列 • 能提高mRNA翻译效率的特殊核苷酸序列，称为 翻译增强子。 •
第二章基因工程制药part2
•共表达大肠杆菌稀有密码子tRNA基因
•表达水平高的基因呈现的密码子偏爱性高于表达水平低的基因
第二章基因工程制药 part2
2020/12/10
第二章基因工程制药part2
•表达质粒的优化和设计
•在各种表达载体中，启动子和SD序列的下游都设计了一 段含有各种限制性酶切位点的序列，用于目标基因的插 入。这一插入位点附近的序列将成为核糖体结合位点的 一部分，因此它对构建高效表达质粒是至关重要的。 •由于每一个基因都具备各自独特的5‘端结构，最终构建 成的各种表达质粒所具有的核糖体结合位点是一个变量。
第二章基因工程制药part2
•共表达大肠杆菌稀有密码子tRNA基因
• 现在还没有一个固定规则来判定稀有密码子的存在 是否确实会对翻译过程产生明显的不利影响。因为稀有 密码子存在的位置、分布的均匀性、mRNA的二级结构 的不同决定了它对翻译是有差别的。所有的结论要通过 实验才能得出。 • • 由于大肠杆菌防御体系的自身保护作用，大肠杆菌 中的核酸酶和蛋白质水解酶能够降解目标基因 mRNA 和目标基因产物，这种降解作用程度对不同的基因或蛋 白质而言是不同的，具有一定的专一性和选择性。
•共表达人或小鼠的蛋白质二硫键异构酶（PDI）
PDI 能互补dsbA缺陷株，但在dsbB缺陷株对目标蛋白的二硫键形成和正确折叠的促进作用可
以受到谷胱甘肽的调节。
PDI 具有的二硫键异构，交换和功能有效地弥补了DsbA
和DsbB功能上的不足，从而提高了目标蛋白正确折叠的
第二章基因工程制药part2
•共表达大肠杆菌稀有密码子tRNA基因
• 在所有的大肠杆菌稀有密码子tRNA中，tRNA Arg （AGG/AGA）含量最少，而AGG和AGA密码子在真核 基因中经常出现。
• 人尿激酶原 ProUK，新型组织纤溶酶原激活剂NTA 等基因中都含有较多的 AGG 和 AGA 密码子，在大肠杆 菌中直接表达的水平很低，但在大肠杆菌中共表达 tRNA Arg（AGG/AGA）基因argU后，这些基因的表达水平能 明显得到提高。 •
比例。
第二章基因工程制药part2
•大肠杆菌表达系统研究的发展趋势
•降低蛋白质合成的速率，从而增加正确折叠重组蛋白质 从phoA基因合成速度低的突变株中发现其分泌在周 质空间的phoA 的产物-----碱性磷酸酯酶比野生型菌株有显 著增加，由于只有构象正确的酶原才能被大肠杆菌蛋白转 运系统识别和分泌，这一结果表明了目标蛋白合成的速率 能对其构象形成正确与否产生影响。
•现已阐明的在大肠杆菌中的稀有密码子有： •编码 Arg 的密码子 AGA、AGG、CGA、CGG •编码 Pro 的密码子 CCC、CCU、CCA •编码 Cys 的密码子 UGU、UGC •编码 Gly 的密码子 GGA、GGG •编码 Leu 的密码子 CUA、CUC •编码 IIe 的密码子 AUA •编码 Ser 的密码子 UCA、AUG、UCG、UCC •编码 Thr 的密码子 ACA
第二章基因工程制药part2
•提高目标蛋白的稳定性的措施
1. 利用蛋白转运系统把目标蛋白最终积累在周质空间， 或分泌到培养基
2. 采用缺乏某些蛋白水解酶基因的缺陷株作为宿主菌。 3. 对分子量较小的目标基因进行融合表达或串联聚合表
达。 4. 共表达能提高特定目标稳定性的辅助因子，如分子伴
侣基因。 5. 对蛋白质序列中的蛋白质水解酶敏感区域和识别位点
得
• 较高水平的表达，需要构建蛋白水解酶活性低的工程化宿
主
• 菌。
• rpoH 基因编码大肠杆菌 RNA聚合酶的r32 亚基，r32
亚
• 基对大肠杆菌中多种蛋白水解酶的活力第有二章正基因调工程控制药作par用t2 。
•大肠杆菌表达系统研究的发展趋势
• 构建各种表达载 体
•建立新的表达系统 •目前研究的重点完善现有的表达系统，解决表达系统中还存 •在的缺陷等方面。这些研究工作主要包括： • 重组蛋白质的正确折叠、构象形成和分泌 • 菌体表面表达技术及其应用 • 重组蛋白质修饰加工研究
第二章基因工程制药part2