在脑片水平上突触可塑性长时程增强的研究进展1郑小波1, 田心1*，宋毅军21 天津医科大学 天津市神经病学研究所，天津 （300070）2 天津医科大学总医院, 天津 （300052）E-mail：tianx@摘要: 长时程增强（Long-term Potentiation, LTP）是突触效能的重要表现形式，是研究学习与记忆突触机制的客观指标。
近年来随着脑片技术的发展，很多关于LTP的实验研究都在脑片水平上进行，本文介绍了海马脑片CA1区LTP的调节表达机制的研究，海马脑片上诱导产生的LTP的特征和脑片条件的关系，多巴胺转运蛋白阻断剂通过活化D3多巴胺受体增强海马脑片CA1区LTP，以及激活大鼠海马脑片CA1区突触β-肾上腺素能受体增强联合LTP的研究，综述了在脑片水平上研究LTP的诱导表达维持及调节等方面的研究动态进展。
关键词: 脑片；突触可塑性；突触效能；长时程增强1.引言突触的长时程增强(Long-term Potentiation, LTP)效应和学习、记忆机制密切相关，1973年Bliss[1]等发现家兔海马经短暂高频刺激后，神经元兴奋性突触后电位可增大并持续几小时甚至几周，他将这一现象称为长时程增强效应。
其后，许多研究人员也在实验中观察到LTP 的存在。
LTP的形成是一个非常复杂的过程，其形式和机制是多样的，因所在部位与接受刺激的不同而不同。
脑片是指从动物脑区制备的厚度为100~700μm能够在体外存活一定的时间的脑薄片，脑片技术起始于20世纪50年代Li和McIlwain的离体脑片电生理研究。
脑片兼有在体脑实验和离体神经细胞培养的某些特点，在体外48小时内依然能保持良好的活性，离子通道性质不会发生变化，离体脑片保持有完整的神经突起和神经解剖通路，便于研究突触活性。
在脑片的电生理过程中排除了活体血压、温度、电解质、血脑屏障等因素的干扰，可以按不同的实验目的直接准确地改变脑片灌流液的成份和条件，如温度、酸度和渗透压、通氧状态、以及离子通道或细胞信号转导通路的阻断剂等；还能借助显微镜准确地放置记录电极和刺激电极。
因此近年来在脑片水平上研究长时程增强有了长足的发展，以下以几个例子来说明脑片水平上LTP的研究进展。
2.在海马脑片水平上研究CA1区LTP的调节表达在海马CA1区和CA3区由短暂的NMDA受体诱导产生的LTP已得到确认，然而，由AMPA 受体介导的突触传递的增强仍是研究的热点，已有实验表明突触后的改变极有可能是突触上AMPA受体数量的增加[2]或者是它们单通道电导的增加[3 , 4]；然而，也有实验表明当突触前__________________________1本课题得到国家自然科学基金（30770545），天津市自然科学基金（07JCYBJC17100）资助*通讯作者：田心 Email：tianx@- 1 -释放的L-谷氨酸增加时可以诱发LTP的表达。
在海马，各个突触之间递质释放的概率和突触上的AMPA受体的数量都是高度差异的，这种差异在发育过程中还被放大，因为突触的成熟和突触内的囊泡的大小和数量[5]以及AMPA受体的数量[6]都是相关的。
Benke通过脑片水平上的LTP实验[7]研究，发现从出生后13天至15天的大鼠制备的海马脑片上CA1区突触上的LTP有两种表达机制：AMPA单通道电导率的增加和AMPA受体数量的增加。
为了验证这两种机制都参与了LTP的表达，Palmer等[8]研究了出生后6天的大鼠海马脑片的LTP表达，他们发现了两种不同的表达机制：递质释放概率的增加或是功能释放位点的增加以及AMPA受体单通道电导率的下降。
这个结果揭示了突触上LTP的又一完全不同的表达机制。
3.海马脑片上诱导产生的LTP的特征和脑片的恢复条件相关Bliss和Lomo在活体标本上首次发现长时程增强在神经元网络编码记忆中起到重要作用[9]，但在描述其机制方面则是在体外脑片上取得重大进展的[10]。
维持脑片活性有两种不同的技术：交界式脑片孵育：脑片部分浸入人工脑脊液（ACSF）中，上表面暴露在湿化的含95% O2和5% CO2的气体，这种孵育方式，脑片得到氧气是通过氧气在脑片上表面的扩散；全浸式脑片孵育：脑片全部浸入在人工脑脊液中，在这种孵育方式中，脑片是从溶解在人工脑脊液中得到氧气。
孵育脑片方式的选用取决于实验目的，例如当采用共聚焦成像技术时采用全浸式脑片孵育。
这两种不同的脑片孵育方式对脑片的细胞生理有不同的影响，例如，最近研究发现α-钙调蛋白依赖性激酶ІІ的磷酸化，这种酶在LTP 诱导中起关键作用，在全浸式脑片中短暂升高，而在交界式脑片孵育方式中则持续降低[11]。
脑片切片后，必须恢复1.5小时后才开始记录，在恢复和记录过程中不一定要采用同一种孵育方式。
Capron等人[12]通过实验发现脑片恢复期采用全浸式孵育时有助于长效的LTP的诱导和维持，在实验中的ACSF中含有的Mg2+的浓度为1mM时，恢复期采用全浸式和交界式孵育脑片，通过单个高频刺激脉冲串（100Hz，1s）诱导产生的LTP的维持具有重大影响，当恢复期和记录期都采用交界式孵育时，由单个脉冲引出的场兴奋性突触后电位（field excitatory post-synaptic potential, fEPSP）的初始斜率增强值可达到177±9%，4小时后降到111±7%，这个水平和诱导前无明显差异，LTP的持续时间由fEPSP的斜率增高到和基线无明显差异为1.5小时，相比较而言，当脑片恢复期采用全浸式，而记录期采用交界式时，单个脉冲（100Hz，1s）引起一个强烈的长效的LTP，它的起始值为正常基线的268±20%，十分钟后降至198±14%，然后稳定在这一水平，4小时后为基线的189±4%，这个值明显高于恢复期和记录期都采用交界式的记录值，他们还发现这种效应的产生和神经元的兴奋性改变没有联系，因为两种实验方式下fEPSP基线值是相似的，fEPSP发生变化时间也是相似的。
Capron等人还研究了采用全浸式-交界式的实验模式，Mg2+浓度为1mM，通过单个刺激脉冲引起的L-LTP的特征，当脑片从30分钟前到LTP产生后的45分钟往孵育的溶液里加入一种蛋白合成抑制剂CHX时，长时程增强的后一阶段就消失了，在CHX浓度为80μM时，LTP 产生4h后降到基线的135±16%这和对照组的测量值有显著差异（p＜0.05）而和基线水平无显著差异(p=0.11）。
他们在自己的实验条件下发现通过一串脉冲诱导的长效的LTP是依赖于蛋白合成的，然而蛋白合成是通过ERK或者P42/14MAPK途径而不是依赖于PKA信号途径，- 2 -因为当孵育的脑片暴露在PKA的抑制剂KT5720（1μM）时，由刺激脉冲诱导产生的LTP4小时后值为基线的162±21%，和对照组值无明显差异（p=0.35）但和基线值有显著差异（p＜0.5），相比较，当脑片暴露在一种MEK的抑制剂U0126（20Μm），（MEK是ERK的特异性激活酶），诱导产生的LTP4小时后值降为133±16%）明显低于对照组（p＜0.5）而和基线无显著差异（p=0.11）。
4.通过活化D3多巴胺受体增强海马脑片CA1区的LTP在海马CA1区，LTP被多种神经递质调节，其中之一是多巴胺[13]。
这种对海马CA1区突触可塑性的调节是通过激活多巴胺受体[14]，已经有许多研究者通过应用外源性多巴胺受体激动剂/拮抗剂来研究其对海马脑片CA1区LTP的影响。
比如，Otmakhova和Lisman[15]通过应用多巴胺D1/D5激动剂使诱导产生的LTP幅度增大，Swanson-Park等[16]应用D1/D5拮抗剂SCH23390则产生了海马脑片和活体上的LTP幅度的下降， Li 等[17]发现多巴胺激动剂也改变了LTP的阈值，这样的话一个微弱的刺激也可以在平时不产生LTP时产生LTP，多巴胺已经被证明参与调整海马CA1区的LTP。
Swant 和Wagner[18]应用从成年雄性S-D大鼠中制备的海马脑片，通过显微镜去除海马CA3区后，将CA1区脑片在氧饱和的标准脑脊液中孵育并持续通氧1小时后开始进行实验。
他们采用细胞外记录技术，把充灌了标准脑脊液的细胞外记录电极（尖端直径为1μm）定位在CA1区的辐射层，通过位于CA3或在记录电极的下脚边的双刺激电极诱发场兴奋性突触后电位（field excitatory post-synaptic potential, fEPSP），刺激脉冲由单个持续时间为300μsec，电流强度为30-125μA方波组成，数据以10kHz的采样频率采集，用1kHz低通滤波，通过pCLAMP9.2软件分析。
他们选用GBR12935（一种多巴胺转运体阻断剂），SCH23390（特异性选择D1/D5多巴胺受体阻断剂），7-OH-DPAT（D3多巴胺受体激动剂），U99194（D3多巴胺受体阻制剂）等药物进行了实验，通过刺激Schaffer侧枝在CA1区辐射层记录fEPSP，并通过比较对照组和不同给药组的刺激反映曲线来确定所给药物所起的作用。
通过比较对照组和GBR12935处理组的刺激反映曲线，显示两组fEPSP反应基线无明显差异说明GBR12935并不影响突触的应答，但是在正常对照组强直后30分钟LTP的正常幅度为1.57±0.05而应用GBR12935处理过的脑片强直后30分钟LTP的幅度显著提高到1.94±0.11（p＜0.05），他们还对各种GBR12935浓度对LTP的影响都做了实验，发现在GBR12935浓度为100nM时p＜0.05，浓度在300nM时p ＜0.01，浓度在1μM时p＜0.001。
图1 GBR12935浓度和标准化了的LTP强度值直方图(摘自Swant 和Wagner[18]，2006) Fig.1 The bargraph of GBR12935 concentration and normalized LTP magnitude- 3 -以上是他们实验所得到的GBR12935浓度和标准化了的LTP强度值直方图。
他们为了进一步研究GBR12935对LTP的作用机制在GBR12935作用前30分钟加入多巴胺D1/D5拮抗剂SCH23390或D3拮抗剂U99194，他们发现D1/D5拮抗剂的加入不会明显改变GBR12935对LTP的影响，在同时存在SCH23390（1μM）和GBR23390（1μM）时，LTP的幅值显著增加到1.90±0.14，而在D3拮抗剂U99194可以阻断GBR12935对LTP的增强作用，在同时存在U99194（1μM）和GBR12935（1μM）时LTP的幅值为1.58±0.08，但是这种拮抗剂的作用并不是因为U99194产生了对LTP的全面下降，因为脑片单独使用U99194处理后，LTP的幅值和空白对照无差异.单胺转运蛋白的阻断会增加内源性单胺神经递质的活化，多巴胺转运体（DAT）拮抗剂对LTP的影响是通过在海马脑片上使用场兴奋性突触后电位（fEPSP）的记录来评价[19]的，使用DAT特异性的阻断剂GBR12935（100nM）就可以对海马Schaffer侧枝突触的LTP有明显的增强作用。