临床检验基础学实验指导血液常规检验一、微量吸管得使用、毛细血管采血、计数板得鉴定与使用【实验目得】:掌握微量吸管得使用、毛细血管采血、计数板得鉴定、构造与使用、【实验试剂】:红细胞稀释液、75％乙醇、消毒药棉。
【实验器材】: 一次性采血针、计数板、盖玻片、微量吸管、2ml吸管、中号试管、显微镜、小玻璃棒。
【实验原理】:一次性采血针刺破毛细血管后,用微量吸管吸取一定量得血液,稀释一定得倍数,冲入计数池计数一定体积内得细胞得数量。
【实验方法】:一、微量吸管得使用:用抗凝血训练微量吸管得使用、二、毛细血管采血(以红细胞计数为例):准备:取清洁干燥试管一支,加2ml红细胞稀释液。
采血部位选择、按摩→75％乙醇棉球进行刺针部位皮肤消毒→待酒精挥发干(否则血流不成滴)→自指尖腹内侧迅速刺针→擦去第一滴血→准确吸取10ul血液→用无菌干棉球压住伤口止血→用无菌干棉球擦去管尖外围余血后→将血液释放到稀释液底部→回吸上清液2－３次→轻轻混匀。
三、计数板构造与应用1.计数板构造外观构造:每块计数板由“H”型凹槽分上下两个计数室,在计数室两侧各有一条支柱,比计数室高出0、1mｍ,将一块平整光滑得血细胞计数专用盖玻片(24.0mｍ×20、0ｍm×0、6ｍm)覆盖其上时,盖玻片与计数室间形成0.1ｍm得缝隙、格子构造:计数池长、宽各3mｍ,平均分成9个大格,每个大方格得容积就是0。
1 mｍ３四角得四个大方格分别用单线划分成16个中方格,就是白细胞计数区域;中央得大方格用双线条划分成25个中方格,每个中方格又用单线划分成１6个小方格,其中四角与正中得5个中方格就是红细胞计数区域。
２、计数板得使用:用清洁干燥柔软得纱布擦拭计数板及盖玻片→用推盖法从计数板下缘向前平推盖玻片将其盖在计数室上→充分混匀细胞悬液→充池→静置→观察细胞分布情况(若严重不匀,应重新充池、)【注意事项】:1.采血部位应选择皮肤完整,不能有烧伤、冻疮、发绀、水肿或炎症。
2.针刺应迅速,深度适宜(约2—3mｍ)、待血液自行流出,擦去第一滴血。
3。
微量吸管取血时应将微量吸管管尖侧着插入血滴中央。
若血流不暢,可以左手自采血部位远端向指尖稍压力至血液流出为止。
切忌用力挤压,造成组织液混入,影响结果准确性。
4.计数板在使用中勿让手指接触计数池及盖玻片表面,以访油腻污染,致使充液时起泡。
二、血涂片得制作,瑞氏染色【实验目得】:掌握血片制作方法,瑞氏染色原理及方法。
【实验试剂】:瑞-吉氏复合染液 (Ⅰ液、Ⅱ液)【实验器材】:显微镜、载玻片、推玻片、一次性针头、消毒棉球、洗耳球【实验原理】:细胞得着色既有化学得亲与作用,又有物理得吸附作用,不同得细胞由于其所含化学成分不一样,化学性质各不相同,所以对染料得亲与力也不一样,因此将细胞染成不同得颜色、【实验方法】:一、瑞一吉氏复合染液配制Ⅰ液:取瑞特染粉1ｇ,吉姆萨染粉０、3g,置洁净研钵中,加少量甲醇(分析纯),研磨片刻,吸出上层染液,再加少量甲醇,继续研磨,再吸出上层染液。
如此连续几次,共用甲醇5０0ml、收集于棕色瓶中,每天早晚各振摇3′共5天,再存放一周,将染液过滤后即可使用。
Ⅱ液:磷酸盐缓冲液(ＰH6、５-6。
8),取磷酸二氧钾(无水)6。
64g,磷酸氟二钠(无水)2。
5６ｇ,加少量蒸馏水溶解,调整PＨ后,加水至1000ｍl。
二、血片制作、瑞氏染色方法准备:取清洁干燥载玻片,边缘光滑清洁推玻片各一张、１、制备血涂片:取载玻片→取血1滴于载玻片右端(边缘留1。
5cm空隙)→左手持载玻片,右手持推玻片→将推玻片放至血滴前沿逐渐后移至血滴沿推片散开后,推玻片与载玻片成30°~３5°得夹角以平稳得速度将血液向前推进→干燥(手持载玻片末端迅速在空气中挥动干燥)。
2、染色:将干透得血涂片放在水平位置→加瑞吉氏复合染液Ⅰ液数滴,以染液覆盖整个血膜为度→静置染0、5～1min→滴加约2倍于Ⅰ液量得Ⅱ液→用洗耳球吹气混匀→染色５—10ｍｉn→平持玻片用流线型水洗→干燥→镜检【注意事项】:1.严格皮肤消毒。
2。
血滴大、血黏度高、推片角度大、速度快则血膜厚,反之则血膜薄。
3。
染料放置时间越长,美兰逐渐氧化为天青,染色效果越好。
4.染液淡,室温低,细胞多则染色时间长,反之减少染色时间。
５.水洗方法为平持血涂片流线型水缓缓冲洗干净,不要先倒掉染液。
三、白细胞计数(WBC)【实验目得】:掌握白细胞计数得原理、操作方法与结果报告、【实验原理】:用白细胞稀释液将全血稀释一定得倍数并破坏红细胞,充入血细胞计数池,显微镜下计数一定体积得白细胞数,经换算求出每升血液中得白细胞数量。
【实验试剂】:白细胞稀释液【实验器材】: 显微镜、改良Neubaｕer计数板、试管、微量吸管、玻璃棒【实验方法】:准备:取清洁干燥试管一支,加０、38mｌ白细胞稀释液。
采血部位按摩→７5％乙醇棉球进行刺针部位皮肤消毒→待酒精挥发干(否则血流不成滴)→自指尖腹内侧迅速刺针→擦去第一滴血→准确吸取２0ｕl血液→用无菌干棉球压住伤口止血→用无菌干棉球擦去管尖外围余血后→将血液轻轻释放到稀释液底部→回吸上清液2－3次→混匀→室温静置至液体变为棕褐色即红细胞破坏完全→清洁计数板、盖玻片→充池→静置２—3min待细胞下沉→低倍镜下计数四角大方格内得白细胞总数→计算→报告、计算:WBＣ=四个大方格内得白细胞数(N)/4×10×2０×106=Ｎ/2０×１０9／Ｌ【注意事项】:1、采血部位应选择皮肤完整,不能有烧伤、冻疮、发绀、水肿或炎症。
2.针刺应迅速,深度适宜(约2—3mm)。
待血液自行流出,擦去第一滴血。
3、稀释液要过滤使用,试管、计数板均须清洁,以免混入杂质被误认为白细胞。
4。
加稀释液、血液量应精确,以保证稀释倍数。
5.计数池内细胞分布要均匀,每个大方格间白细胞数差异不得超过均值得±１０％,否则要重新充液计数。
6、严格掌握计数原则,以免人为扩大或缩小计数区域。
７。
白细胞数量过高时,可加大稀释倍数,反之白细胞过低时可计数8个大方格内白细胞数或加大取血量。
四、白细胞分类计数(DＣ)【实验目得】:掌握显微镜法外周血分类计数得方法、各种白细胞得镜下形态。
【实验原理】:将血液制备成涂片,经瑞－吉氏染色后显微镜下根据白细胞得形态特征进行分类计数。
通常分类100个白细胞,计算得出各种白细胞所占百分比。
【实验试剂】:瑞－吉氏复合染液【实验器材】:显微镜、外周血标本片、香柏油、擦镜纸、清洁剂【实验方法】:准备:血涂片制备及瑞－吉氏染色待干低倍镜下选择细胞分布均匀、着色良好得区域→转油镜按一定得规律移动视野,依次进行分类计够1００个白细胞→算出各种白细胞得百分比→报告【注意事项】:1.涂片制备要厚薄适中、均匀、头体尾分明、2。
分类时要有程序地连续进行,避免主观选择视野。
３、分类中如见幼红细胞,不计入100个白细胞内,以分类1０0个白细胞过程中见到幼红细胞多少个来报告,并应注明其所属阶段,4、分类中应注意观察成熟红细胞、血小板得形态染色及其分布情况,注意有无寄生虫(如疟原虫)及其她异常所见。
五、白细胞计数(WBＣ)及分类计数(DC)【实验目得】:掌握白细胞计数及分类计数原理、方法与结果报告【实验原理】:白细胞计数原理:用白细胞稀释液将全血稀释一定得倍数并破坏红细胞,充入血细胞计数池,显微镜下计数一定体积得白细胞数,经换算求出每升血液中得白细胞数量。
白细胞分类计数原理:将血液制备成涂片,经瑞－吉氏染色后显微镜下根据白细胞得形态特征进行分类计数。
通常分类１００个白细胞,计算得出各种白细胞所占百分比。
【实验试剂】:白细胞稀释液、瑞-吉氏复合染液【实验器材】:显微镜、改良Neｕbauer计数板、试管、微量吸管、玻璃棒、载玻片、推玻片、香柏油、擦镜纸、清洁剂【实验方法】:准备:1。
取清洁干燥试管一支,加0。
38ｍl白细胞稀释液。
2、取清洁干燥载玻片,边缘光滑清洁推玻片各一张。
采血部位按摩→７5％乙醇棉球进行刺针部位皮肤消毒→待酒精挥发干(否则血流不成滴)→自指尖腹内侧迅速刺针→擦去第一滴血→准确吸取20ul血液→用无菌干棉球擦去管尖外围余血后→将血液轻轻释放到稀释液底部→回吸上清液2-3次→混匀→另取血一滴于载玻片得右端→立即推制血膜→用无菌干棉球压住伤口止血→清洁计数板、盖玻片→充池(静置2－3min待细胞下沉)→低倍镜下计数四角大方格内得白细胞总数→将干透得血膜进行瑞-吉氏染色→油镜下分类计数→计算→报告。
六、红细胞计数(ＲBC)、Hb测定【实验目得】:掌握红细胞计数,Ｈb测定原理、操作方法,规范得报告结果【实验原理】:红细胞计数原理:用等滲稀释液将血液稀释一滴倍数,充入计数池,在显微镜下计数一定体积内得红细胞数,经换算求得内升血液中得红细胞数。
Hb测定(HiCＮ法)原理:血红蛋白被高铁氰化钾氧化为高铁血红蛋白,后者再与氰离子结合形成稳定地氰化搞铁血红蛋白(ＨiCN),HiＣN在规定波长(５4０nm)与液层厚度(1ｃm)得条件下具有一定得毫摩尔消光系数。
可用标准得高精度分光光度计进行直接定量测定,或用HiCN标准液进行比色法测定,根据标本得吸光度即可求出血红蛋白浓度。
【实验试剂】:红细胞稀释液(甲醛枸木缘酸盐稀释液), HｉCＮ转化液【实验器材】:改良Nｅuｂauer计数板、显微镜、分光光度计、玻璃试管、微量吸管、玻璃棒、【实验方法】:ＲBC:取清洁干燥试管一支→加红细胞稀释液１、99ml→加未梢血１０ul于稀释液底部→吸取上清液嗽洗3-４次→颠倒混匀→清洁计数板,盖玻片→充液→静置2′—3′→计数(中央大格中四角及正中５个方各细胞数)→计算RBC=5个中方格细胞数×5×10×2０0×10６=5个中方格细胞数×1012/L。
Ｈb测定:1。
直接定量测定法:取中号试管一支→加HiＣN转化液5ml→加未梢血２0ul→混匀静置5′→7２１比色,波长５４0nm,以转化液为空白对照管→测其吸光度“A”→计算(“A"×3６7、7)→报告2.标准曲线法:将血红蛋白标准液稀释成不同得三种浓度(150g/L、１０0g/L、50g/L)分别测其吸光度“Ａ”,以“A”为纵坐标,血红蛋白标准液参考值(g/Ｌ)为横坐标,绘制标准曲线。
通过标准曲线查出待测样本得血红蛋白浓度。
【注意事项】:1、取血应顺利、准确,采血部位不得有烧伤、冻疮、发绀、水肿或炎症,不得过渡挤压,红细胞数量明显增高者可适当加大稀释倍数、2。
HiCN转化液应置棕色瓶于4℃冰箱中,不能储存于白色瓶、塑料瓶及强光下,否则会使CN－丢失,结果偏低。
3.ＨiＣＮ转化液中有氧化钾剧毒,防止污染。