文章编号（Article ID）：1009－2137（2011）04－1010－05·论著·不同培养基对人外周血单核细胞来源树突状细胞发育的影响陈晨，刘元林，梁晓雷，朱恒，李红，吴英，毛宁，张毅军事医学科学院基础医学研究所细胞生物学研究室，北京100850摘要本研究旨在探讨RPMI1640和IMDM两种培养液对诱导人外周血单核细胞向树突状细胞（DC）发育分化的影响。
利用GM-CSF+IL-4细胞因子组合，在培养条件一致的前提下，改变培养液种类，通过对成熟、未成熟DC形态观察，用流式细胞术检测细胞表型和吞噬能力、应用混合淋巴细胞反应（MLR）检测其刺激T细胞的增殖能力，用悬浮芯片技术检测DC与同种异体T细胞共培养后上清中所含细胞因子的变化，分析不同培养液对DC功能的影响。
研究结果表明，两种培养液培养所得的DC在形态上无显著差异，DC的吞噬能力以及CD14和CD83的表达亦无显著差异，但应用IMDM培养的DC的CD1a表达明显降低，且对T细胞增殖的刺激能力也显著降低；IMDM培养的DC高表达IL-6、IL-8和IL-10，而IL-12的表达则显著降低。
结论：不同的培养体系可获得功能不同的DC，IMDM培养的DC可能与免疫耐受有关，本研究结果为DC在临床上的应用提供了新思路。
关键词RPMI1640；IMDM；单核细胞；树突状细胞中图分类号R329．28文献标识码AEffect of Different Culture Mediums on the Development of Monocyte-derived Dentritic CellsCHEN Chen，LIU Yuan-Lin，LIANG Xiao-Lei，ZHU Heng，LI Hong，WU Ying，MAO Ning，ZHANG Yi Department of Cell Biology，Institute of Basic Medical Sciences，Beijing100850，ChinaCorresponding Author：ZHANG Yi，Professor，Senior Scientific Researcher．Tel：（010）66931320．E-mail：zhangyi@nic．bmi．ac．cn Abstract This study was aimed to investigate the effect of RPMI1640and IMDM on the development of human peripheral blood monocyte-derived dendritic cells．Under the same cytokines and culture conditions，the different medium types were tested，and the morphology of mature and immature dendritic cells was observed by microscopy，the cell phenotype and endocytosis ability were detected by flow cytometry．Furthermore，the immunoregulatory function of various DC was analyzed by mixed lymphocyte reaction（MLR），the expression of cytokine in culture supernatant of MLR system was also analyzed by Bio-plex technology．The results showed that there were no difference in morphology，CD14，CD83 expression and endocytosis ability between IMDM-cultured DC and RPMI-1640medium-cultured DC，but there was a lower expression of CD1a in IMDM-cultured DC．Moreover，DC cultured with IMDM displayed a significant reduction in stimulating T cell proliferation，and highly expressed IL-6，IL-8and IL-10，but low expressed IL-12．It is concluded that the different cultural mediums can induce DC with different functions and DC cultured with IMDM may correlated with induction of immune tolerance．The results of this study will provide a new idea for DC clinical application．Key words RPMI1640；IMDM；monocyte；dentritic cellJ Exp Hematol2011；19（4）：1010－1014树突状细胞（dendritic cells，DC）作为一种重要的免疫辅佐细胞，是体内最强的抗原呈递细胞。
它最大的特点是能够显著刺激初始型T细胞，激发机体免疫反应，在诱导免疫应答中起关键作用［1］。
因此DC在人类重大疾病（如肿瘤、移植免疫等）的发病和治疗中具有重要的研究价值。
由于DC在体内含量很低，约占白细胞总数的1%－2%，且缺乏特异性的表面分子加以识别与纯化，因此近年来有关DC种类和功能的研究成为焦点。
目前有关DC来2+造血干细胞来源的DC，另一种是外周血单核细胞来源的DC。
体外培养DC的培养液为RPMI1640［2，3］，结合粒巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimu-lating factor，GM-CSF）和白介素4（interleukin-4，IL-4），可诱导获得CD1a+CD83+具有抗原呈递功基金项目：国家重点基础研究资助项目（编号2010CB833604）；国家自然科学基金面上项目（编号31070996通讯作者：张毅，教授、研究员．电话：（010）66931320．E-mail：zhangyi@nic．bmi．ac．cn2011－02－14收稿；2011－03－29接受·0101·中国实验血液学杂志Journal of Experimental Hematology2011；19（4）：1010－1014能的DC。
另外，近年人们发现还有一种具有免疫耐受作用的DC。
初步研究结果显示，在免疫抑制因子的刺激下，可诱导获得具有抑制体内免疫反应的DC，在移植免疫和自身免疫性疾病的治疗中将发挥重要作用。
有关如何获得免疫耐受型DC成为当前DC领域的研究热点，为此本研究试图通过改变培养液种类，结合细胞因子配伍，探讨诱导人外周血单核细胞向耐受型DC的发育分化，为临床应用以及后续研究提供实验依据。
材料和方法材料与试剂IMDM和RPMI1640液体培养液购自Hyclone公司，胎牛血清购自Gibco公司；重组人GM-CSF和重组人IL-4均购自Pepro Tech公司；Ficoll淋巴细胞分离液购自天津血液病研究所；Monocyte isolation kit MiniMACS、Pan T isolation kit MiniMACS购自Miltenyi Biotec公司；流式细胞术相关鼠抗人单克隆抗体CD1a-FITC、CD14-PE、CD83-PE购自BD PharMingen公司；葡聚糖FITC-Dextron购自Sigma 公司；Bio-Plex细胞因子检测试剂盒购自北京BioRad公司；健康供者外周血由军事医学科学院附属307医院血库提供。
DC的培养与形态表型鉴定取正常人外周血，淋巴细胞分离液分离单个核细胞后按照Monocyte isolation kit MiniMACS说明分离CD14+细胞，分别用含10%FBS的IMDM和RPMI 1640完全培养液重悬，调整细胞浓度为1ˑ106/ml，细胞因子配伍为GM-CSF50ng/ml，IL-450ng/ml，种于6孔板中，每孔终体积2ml，于37ħ、5%CO2孵箱内培养，每3天半量换液，培养至第5天，显微镜下观察细胞形态。
同时，向培养5天的培养体系中加入LPS（1μg/ml）刺激细胞成熟，至第7天时在显微镜下观察细胞形态。
另外，收集培养至第5天的未成熟DC （immature DC，iDC）和加入LPS刺激后培养至第7天的成熟DC（mature DC，mDC），分别标记抗体CD14-PE、CD1a-FITC、CD83-PE，用流式细胞仪检测其细胞表型变化。
DC吞噬能力的检测收集用不同培养液培养的iDC和mDC，每管1ˑ106/ml，分别于37ħ（实验组）和0ħ（对照组）孵育1560分钟，用冷PBS终止实验，洗涤后上流式细胞仪检测吞噬效率。
不同DC刺激T细胞增殖能力的混合淋巴细胞反应（MLR）检测应用混合淋巴细胞的反应（MLR）方法进行检测，取健康志愿者外周血，分离单个核细胞，按Pan T细胞免疫磁珠分离试剂盒说明分离CD3+细胞，用含20%FBS的IMDM和RPMI1640培养液分别重悬CD3+细胞，调整细胞浓度为2ˑ106/ml，在96孔板中加入100μl/well作为反应细胞；以30Gy照射后的2种不同培养液培养出的iDC和mDC为刺激细胞。
反应细胞数目不变，将刺激细胞按一定的梯度浓度与反应细胞混合后悬浮于含20%FBS的IMDM或RPMI1640培养液中，在37ħ、5%CO2孵箱内培养96小时，培养结束前16小时加3H-TdR 1μCi/well。
收集细胞，用液体闪烁仪检测cpm值。
细胞因子表达的悬浮芯片法检测收集混合淋巴细胞反应体系中的培养上清，按照BioRad公司悬浮芯片检测细胞因子说明，检测细胞因子IL-6、IL-8、IL-10和IL-12的表达。
统计学分析应用Excel软件进行统计分析，数据以珔XʃSD表示，均数比较用双尾t检验，校验水准α=0．05，p＜0．05有统计学意义。
结果不同培养液对DC发育分化的影响从倒置显微镜下观察细胞形态可以看出，在培养初期RPMI1640培养液培养的DC较IMDM培养的DC形态均一，但随着培养时间的延长，IMDM培养的细胞形态也逐渐均一。