注意：溶解液-酶效价
时间-新鲜组织、酶解时间过长，细胞自溶
pH值-碱性：胃蛋白酶失活
-中性：胰酶活性欠佳 酶纯度 细胞膜改变
2、机械法 -剪碎组织 -100目尼龙网过滤（去除大组织块） -离心1000prm3-5分钟，去上清 -洗三次，每次离心（500~800prm）取上清，
弃细胞碎片
-300目尼龙网过滤去除细胞团块
的存在与定位。
标记胰岛素cRNA探针，示胰岛素mRNA阳性
（六）细胞和细胞化学定量术
1、显微分光光度测量术
2、形态计量术 3、流式细胞术
1、显微分光光度测量术（microspectrophotometry）
应用显微光光度计，以物质分子对光波的选择 性吸收为基础，在显微镜下对生物样品中的化学物
质进行定量分析。
（B）二次荧光（用化学染色）
非荧光性的物质（蛋白质、炭水化合物等） 用荧光色素染色，由荧光色素产生荧光（二次荧 光），以便进行观察，对特定物体选择合适的荧 光色素，该物体就能和周围的组织或细胞区别 （分离）出来而可以观察到。 应用：吖啶橙+核酸
金胺+结核菌
介子奎二噁因+染色体
（C）抗体荧光技术（用免疫染色） 利用特定的抗原必然和特定的抗体相结合这 一个事实，有意识地使带荧光标记的抗体和标本 中的抗原进行抗原/抗体反应，这样两者的结合 体就能通过抗体的荧光观察到。荧光显微镜最常 用于抗体荥光技术进行观察，并成为医学、生物 学很多领域中极为有用的工具。
Glial fibrillary acidic protein
荧光色素+物质 （自发荧光）
激发方法
吸收波长
辐射荧光
维生素A
维生素B6
紫外（UV）
紫外（UV）
325-345nm
356
470-490nm
432
儿茶酚胺
血清素（5-羟色胺）
紫（V）
紫（V）
410（405-415） 480（475-485）
2、形态计量术（morphometry）
运用几何学和统计学原理，对组 织或细胞进行二维和三维的形态测量
研究，如对细胞的数量、体积、表面 积和周长的相对和绝对值的测量等。
3、流式细胞术（flow cytometry）
是近年发展起来的细胞分类和定量研究技术，能对 细胞的生物化学和生物物理特性进行快速定量测定，还 可分选收集各种细胞。该技术的建立为细胞动力学、免
金胺+结核菌
福尔根反应+DNA 溴化乙啶（EB）+DNA
兰（G）
绿（G） 绿（G）
470
550 545
557
650 605
Propidium Iodide（PI）+DNA 绿（G）
DAPI+A-T Mithramycin+G-C Olivomycin+G-C 紫外（U） 兰紫（BV） 兰紫（BV）
530
使无色透明的细胞镜下结构反差明显，图像
清晰。
4、激光扫描共聚焦显微镜（laser scanning confocal microscope） 是近年研制和应用的一种新型显微镜。它将激光束 落在样品上，并作移动扫描，对样品内某种荧光标记的 物质进行二维和三维的动态微量分析测定。可用来研究 活细胞内Ca2、 Na+和 K+等pH值的动态变化；细胞内各 种细胞器、细胞骨架、核酸、蛋白质和受体等的定位和 定量分析；细胞膜电位、膜通道及信息传递的检测；利 用激光对细胞结构或染色体作切割、分离和克隆等逐渐
成为生物医学研究中重要的研究手段。
（三）组织化学术（histochemistry） 应用化学反应与物理反应原理检 测组织或细胞内某种化学成分并进行
定位、定量及相关功能研究的技术。
1、多糖
显示多糖或蛋白多糖的常用方法是过碘 酸—雪夫反应(periodic acid Schiff
reaction,PAS反应)。组织或细胞中的多糖被结
372 395 430
615
456 570 545
荧光色素+物质
（抗体荧光技术）
激发方法
吸收波长
辐射荧光
FITC
TRITC
兰（B）
绿（G）
495
555 568 485-530 540
525
580 597 525-605 470
罗达明（Rhodamine） 绿（G） 尼罗红+溶酶体 派若宁丫+线粒体 兰，绿（B、G） 绿（G）
3、涂片 血涂片 精液 痰液 培养细胞
4、铺片 5、磨片 骨和牙需制成磨片、经染色后观察
（二）电子显微镜技术
电子显微镜（简称电镜）的发明和使用，使组织 胚胎学研究内容发生了深刻变化。光镜分辨率为 0.2um，放大倍数约为1000倍，而电镜的分辨率为 0.2nm，比光镜高1000倍，可放大几万倍至几十万 倍，因此电镜能观察到更微细的结构。在电镜下所 见的结构称为超微结构(ultrastructure)。
1、透射电镜（transmission electron microscope）
用于观察细胞内部结构，标本制备比光 镜的要求更严格，组织块要更新鲜，体积更
小（1mm3），固定常用戊二醛和锇酸。切片
则用超薄切片机，制成50~80nm的超薄切片，
用醋酸铀和柠檬酸铅染色，然后在电镜下观
察并摄片。
2、扫描电镜（scanning electron microscope)
养成活，藉以观察各种物理、化学和生物因素
对组织或细胞的作用，探索和提示细胞生命活 动规律和细胞的结构功能变化。
新鲜实体组织细胞分离 胶原纤维 1、酶消化法原理 紧密连接 粘多糖 常用酶 蛋白酶类-胰酶：脂键、肽键
-胶原酶：胶原
-溶菌酶：糖蛋白和肽的糖苷键 -弹性蛋白酶：糖蛋白和弹性蛋白 血管 心脏 肝脏
（五）原位杂交术（in situ hybridization） 通过检测细胞内mRNA和DNA分子序列片段， 原位显示细胞合成某种多肽或蛋白质的基因表达。 应用某种已知的并被标记的RNA或DNA片段即核 酸探针（cRNA或cDNA），与细胞内的待测核酸 （RNA或DNA片段）进行杂交，通过标记物的显 示在光镜和（或）电镜下观察目的mRNA或DNA
（一）光学显微镜技术
1、一般光学显微镜
2、荧光显微镜 3、相差显微镜
4、激光扫描共聚焦显微镜
（二）电子显微镜技术
1、透射电子显微镜 2、扫描电子显微镜
（三）组织化学术
1、多糖
2、脂类 3、酶 4、核酸
（四）免疫组织化学术
（五）原位杂交术
（六）细胞和细胞化学定量术
1、显微分光光度测量术
2、形态计量术
用于观察组织或细胞表面的微细结构，标 本需经喷镀金属膜特殊处理，然后在扫描电镜
下观察，在荧光屏上扫描成像，呈现富于立体
感的表面图像，如细胞表面的微绒毛、纤毛和
细胞伸出的伪足等。
2、冰冻切片 组织置入液氮（-196℃）快速冻结，恒冷切 片机切片、染色。 更好保存细胞内酶的活性、蛋白质结构。
390（385-400） 530（520-540）
叶绿素
兰（B）
520
650-660
荧光色素+物质
激发方法
吸收波长
辐射荧光
（二次荧光）
芥子奎二噁因 四环素+骨，牙 吖啶橙+DNA 吖啶橙+RNA 兰紫（BV） 紫（V）或兰（B） 兰（B） 兰（B） 450 390 460 460 500 560 530 650
荧光的观察（按标本分类）
在荧光显微镜下观察的标本，当然必须发 出荧光，可是大多数标本本身不能发出荧光，因
而必须用荧光色素处理过才能发出荧光。
（A）自发荧光 （B）二次荧光
（C）抗体荧光技术
（A）自发荧光（不加染色） 有些物质不加染色，也能发出荧光（自发 荧光或原发荧光），但在医学和生物学（细胞 学、生物组织、培养体等）领域中，只有很少 物质具有自发荧光，常采用后两种方法。 测定物质的荧光光谱或者激发光谱，可以 判定物质性质（荧光光度法）。 应用：生物学方面——判定维生素，研究 生物学上的生物源的胺。
疫学、血液学和肿瘤学等的研究提供了重要的研究手段。
如细胞周期各时相细胞的比例，同步分析细胞内DNA、
RNA和蛋白质的含量，T淋巴细胞亚群的分离和定量，
淋巴细胞表面受体的分析，分离和浓缩造血干细胞，血 细胞增殖情况，恶性肿瘤早期诊断，药物作用机制等。
（七）组织培养技术（tissue culture） 是将离体的细胞、组织或器官置于培养基 中，在无菌和适宜温度及酸碱度条件下进行培
缺点：组织片厚，经冷冻后易破坏组织结构
2、荧光显微镜（fluorescence microscope）
由光源、滤光系统和显微镜三个部分 组成。光源为高压汞灯，可产生紫外光，
标本中的自发荧光物质或经荧光素染色或
标记的结构在紫外光激发下可产生各种颜
色的荧光，以此来研究该荧光物质在细胞
和组织中的分布。
3、相差显微镜（phase contrast microscope） 用于进行细胞培养中活细胞的观察，可
研究技术
（一）光学显微镜技术
（二）电子显微镜技术
（三）组织化学术
（四）免疫组织化学术
（五）原位杂交术
（六）细胞和细胞化学定量术
（七）组织培养术 （八）放射自显影术
问
题
解决方法 放大 显微 光线不能透过观察对象 观察对象缺乏反差 观察对象生化成分不同
免疫组织化学
观察对象为生活状态 培养
合形成紫红色沉淀物。此反应称PAS阳性反应， PAS阳性部位为多糖存在部位。
2、脂类
标本用甲醛固定，冷冻切片，用油红O、 尼罗蓝或苏丹类染料染色，使组织和细胞