组织块石蜡包埋的步骤：
1.取材：尽量活杀，在处死30min内取材完毕，组织块的大小一般为（1.0-1.5cm）
*1.0cm*(0.2-0.3cm)
2.固定：常用甲醛液浓度为4%，是40%甲醛溶液和水按1:9比例配制而成。
固定时间
以12-24h为宜。
（4℃冰箱可放置1-3个月）
3.冲洗：将组织块放在固定的容器中用流水冲洗24h.
4.脱水：一次70%酒精2h, 80%酒精2h, 90%酒精1h, 95%酒精40min,无水乙醇Ⅰ40min,
无水乙醇Ⅱ30min。
可将组织放于70%酒精中过夜。
5.透明：将脱水后组织直接浸入二甲苯透明剂中（二甲苯Ⅰ, 二甲苯Ⅱ），每次透明
为10min。
6.浸蜡：常规制片常用熔点高于56℃以上的石蜡，普通采用56℃-58℃石蜡。
先将组
织浸入软蜡Ⅰ1h左右, 再浸入软蜡Ⅱ40min；硬蜡Ⅰ40min, 硬蜡Ⅱ1h。
（一般浸蜡
时间为3-4h）软蜡熔点为45℃-50℃，硬蜡熔点为55℃-60℃。
7.包埋：将蜡液注入包埋硬具中，迅速将组织块平放入蜡液中，摆正并铺平，然后移
至冷却台，使组织块同蜡液凝固在一起的过程。
（硬蜡凝固定型）
石蜡切片法：
在切片前应先切去标本周围过多的石蜡（此过程称为“修块”），但也不能留得太少，否则易造成组织破坏，连续切片时分片困难。
一般切片厚度为4-6μm。
贴片时先在干净的载玻片上涂一层蛋白甘油，然后于60℃恒温箱中烘烤1h，若未烤干可适当延长时间；若组织剥脱可涂一层蛋清加以固定。
做免疫组化时，玻片应涂多聚赖氨酸，亦可买防脱玻片。
HE染色的步骤：
二甲苯Ⅰ5-10min→二甲苯Ⅱ5-10min→无水乙醇Ⅰ1-3min→无水乙醇Ⅱ1-3min→90%酒精1min→80%酒精1min→70%酒精1min→水洗→苏木精3-5min→水洗→盐酸酒精1-3s→水洗→饱和碳酸锂（氨水）10-30s→水洗→伊红3-5min→水洗（短）→70%酒精1-2s→80%酒精3-5min→90%酒精3-5min→95%酒精3-5min→无水乙醇5-10min→二甲苯Ⅰ3-5min→二甲苯Ⅱ3-5min→中性树胶封片
染色液的配制：
1.Harris苏木精的配制
苏木精 1g
硫酸铝钾 15g
无水乙醇 10ml
蒸馏水 200ml
先用蒸馏水加热溶解硫酸铝钾，用无水乙醇溶解苏木精再倒入已溶解的硫酸铝钾蒸馏水中，煮沸1min后，稍冷却，慢慢加入红色氧化汞0.5g，继续加热至染液变为紫红色，用纱布盖瓶口，用滤纸过滤后每100ml加冰醋酸5ml。
2.伊红的配制
伊红 1g
90%酒精 100ml
先将伊红溶于酒精中，用玻璃棒研碎溶解后，每100ml加冰醋酸1滴。
3.盐酸酒精分化液的配制：
浓盐酸 0.1-1ml
75%酒精 99ml
免疫组化实验步骤：
常规石蜡水化，将石蜡切片浸于二甲苯中5min,三次。
取出切片置于无水乙醇中2次，每次3min；90%酒精、80%酒精、70%酒精，各三次。
取出置于蒸馏水中。
1.取出蒸馏水中的切片，甩干并擦干切片上组织周围的液体，平放于湿盒中，滴加过氧化
物酶阻断剂（常用0.3%过氧化氢）于组织上避光孵育15min。
蒸馏水冲洗，再将切片置于TBS或PBS缓冲液中，浸泡5min，三次。
取出切片，甩干并擦干切片上组织周围的液体，平放于湿盒中。
2.滴加50-100μl一抗工作液于组织上，室温孵育2-3h，用PBS冲洗切片。
将切片置于
TBS或PBS缓冲液中，浸泡5min，三次。
取出切片，甩干并擦干切片上组织周围的液体，平放于湿盒中。
3.滴加50-100μlA液于组织上，室温孵育30min，用PBS冲洗切片。
将切片置于TBS或
PBS缓冲液中，浸泡5min，三次。
取出切片，甩干并擦干切片上组织周围的液体，平放于湿盒中。
4.滴加预备好的显色剂DAB工作液50-100μl，室温孵育5-10min，或光镜下控制显色。
显色完全后，用蒸馏水冲洗终止显色。
5.需要时，苏木精复染，盐酸酒精分化1-2s，水洗。
6.各级酒精（70%、80%、90%、无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ）脱水，每级3min,取出切片置
入二甲苯5min，三次。
7.用中性树胶封片。
SABC试剂盒组分：
A chemMate TM En Vision +/HRP,兔、小鼠 1×5ml
B DAB缓冲稀释液 2×6.25ml
C DAB原液 1×0.25ml
DAB工作液的配制：
实验前按每毫升B液（DAB稀释液）中加1滴（或20微升）C液(DAB原液)的浓度配制所需要的用量，混合后备用。
PBS缓冲液配制：
1×PBS（1000ml）
Nacl(137mM) 4g
Kcl(2.7mM) 0.1g
Na2HPO4(10mM) 0.72g
K2HPO4(2mM) 0.12g
5×PBS（500ml）
Nacl(137mM) 10g
Kcl(2.7mM) 0.25g
Na2HPO4(10mM) 1.8g
K2HPO4(2mM) 0.3g
TGF 1:50-1:200 1:100 孵育3h
MMP 1:50-1:200 1:100 孵育3h
二抗羊抗兔 1:400
组织RNA提取：
1.称取子宫肌瘤和瘤旁组织50-100mg，放入3.5mmRNase Free dish 中，先加入4℃预
冷的Trizol500μl，用眼科剪（RNase Free：用3%双氧水或氯仿浸泡30min，或用DEPC 水浸泡12h）将组织尽可能剪碎，再加入500μlTrizol，混匀后转入RNase Free EP 管中。
2.室温放置5min，加入4℃预冷的氯仿0.2ml/mlTrizol,颠倒混匀（可剧烈），要充分至
出现均匀乳糜状为止，然后静置5min，4℃，14000rpm×15min。
3.小心收集上层水相约600μl，置于另一个EP管（RNase Free）中，避免吸到中间层
和有机相。
4.加入500μl预冷的异丙醇（0.5ml异丙醇/mlTrizol）,颠倒混匀3-5次，-20℃放置
1h或室温静置10min。
5. 4℃，12000rpm×15min，离心后能看到少许沉淀附于EP管底部，弃上清，用滤纸吸
干管口的余液，倒置于滤纸上晾干1min。
6.加入1ml-20℃预冷的75%乙醇（含DEPC），洗涤RNA沉淀。
4℃，12000rpm×5min。
7.弃上清，加入1ml-20℃预冷的无水乙醇，不要冲起沉淀，立即离心，4℃，12000rpm
×5min。
8.弃上清，沉淀中即为总RNA，将EP管倒置于滤纸上，空气中干燥10min，不能干燥过
度。
加入20μlRNase Free H2O溶解沉淀，分装5μl/管，-70℃冰箱保存。
9.总RNA的鉴定：1%琼脂糖电泳鉴定总RNA，观察出现条带的完整性来判断RNA是否降
解。
核酸蛋白测定仪测定RNA的含量和纯度。
1%琼脂糖电泳制胶：
15ml 0.5×TBE+0.125g琼脂糖+2.4μl核酸染料
上样：2μl 5×loading buffer +3μl样本+5μl DEPC水
150V 30min
测RNA含量:2μl样本+98μlDEPC水
TBE电泳缓冲液配制：10× PH7.0
T Tris碱 27g
B 硼酸 13.75g
E EDTA 7.44g
三蒸水 500ml
RT-PCR步骤：
2.按以下条件进行反转录反应(一个循环)
（30℃ 10min） 42℃ 99℃ 5℃ 42℃-60℃ 15-30min 60min 5min 5min 95℃ 5min
5℃ 5min
2.反应条件（25-35个循环）
94℃ 30sec
55℃-65℃ 30sec
PCR凝胶电泳制胶：（1.5%）
15ml 0.5×TBE+0.225g琼脂糖+1.9μl核酸染料
上样：2μl 6×loading buffer +7μl样本+ 3μl灭菌蒸馏水
TGF- length 335 57.0℃
Sense 5′CAC AGT CCG CTA CTT CGT CC 3′20bp
Anti-Sense 5′CCC TAA TGG CTT CCA CCC TC 3′20bp MMP11 length 409 56.9℃
Sense 5′TTC TAC ACC TTC CGC TAC CC 3′20bp
Anti-Sense 5′GGA CTG GCT TCT CAC CAT CAT AT 3′23bp -actin length 592 56.0℃。