基因工程生物技术是近 10 多年来迅速发展起来的高技术、新技术，具有十分明显 的社会高效益和经济效益。

在所有的生物技术领域中，农业生物技术，特别 是有关作物生物技术的研究和发展，同医药生物技术一样被认为是最有现实意义的技术，将在下一世纪出现的“绿色革命”及“医药革命”中发挥巨大 的作用，而这两种生物技术都是以基因工程为基础的。

基因工程自其诞生至今已有十多年历史了，已经形成了一整套的技术路 线。

这主要包括目的基因的取得，目的基因与表达性载体的重组，重组体对 寄主细胞的转化及目的基因的表达，表达产物的纯化与生物活性测定。

在农业生物技术中，植物基因工程取得了一系列引人注目的成果，人们 成功地获得了抗虫、抗病毒、抗除草剂等转基因植物，并已开始了大田实验。

人们可以在一定范围内开始根据意愿来改造植物的一些性状，从而获得高 产、稳产、优质和抗逆性强的品种了。

向动物体转移外源基因并使之在动物 体内表达能够有效地克服物种之间固有的生殖隔离，实现动物物种之间，或 动物和植物及微生物之间遗传物质的交换。

因此，动物基因工程对于深入研 究基因结构、功能及其表达调控，对于培育高产、优质和抗逆动物品种，对 于开发动物体作为活的生物反应器生产珍稀蛋白质等方面，均有巨大应用潜 力；而基因工程在医药领域的应用在于能利用生物体生产基因工程药物，为 人类的健康打下坚实的医学基础。

一、基因转移方法1.向动物体内转入外源基因这一方法的尝试是从 70 年代中期开始的，到 80 年代，科学家们已经相 继建立了多项转基因技术。

(1)显微注射法 这种方法是 1981 年由美国科学家戈登（Gordon）等人首 先实验成功的。

他们将小鼠的受精卵取出来，在显微镜下将胸苷激酶基因用 玻璃微管送入受精卵的雄原核，然后立刻输入假孕母鼠的输卵管中，使其在 子宫内着床，最终发育成转基因小鼠。

在此后约一年多时间内，人的珠蛋白 基因和胰岛素基因也被转入了小鼠。

随后，生产转基因小鼠的经验迅速地被 移植到生产转基因家畜上。

到1985 年，哈默（Hammer）等人首先报道用显微 注射法生产出转基因兔、羊和猪。

显微注射虽然是有效的方法，但转基因动 物生产仍是一项困难的技术，即使具备了良好的设备和训练有素的技术人 员，注射和移植一百个小鼠胚胎，仅能获得五只转基因小鼠。

家畜的胚胎细 胞核不易看清，不能直接注射，必须先作离心处理后才能注射，这样，生产 转基因个体的机率又下降了一个数量级。

鱼类和两栖类的卵是多黄卵，在显 微镜下不易辨认原核，有些科学家采用基因注入卵母细胞核的方法，因为卵 母细胞核大些，可以在显微镜下看见，基因可以注入卵母细胞核中，让卵母 细胞体外成就并受精，最终受精卵发育成小鱼。

(2)动物病毒载体法 与显微注射法相反，动物病毒逆转录病毒对细胞染色体的整合是按照已经了解的机制准确地结合到被传染细胞的基因组中，往 往只有一个单一的病毒拷贝插入到已知的染色体位点上，不易引起寄主基因 组大规模的重排，只会在整合位点上的很短的一段寄主 DNA 序列上产生重 排。

把小鼠胚胎在子宫着床前浸泡在浓的病毒原液中，或是把它们与产生病 毒的单层细胞一起培养，即可达到转基因的效果。

目前，这种方法主要应用 于转基因牛和转基因鸡的生产。

转基因牛生产成本太高，不适宜使用大量注 射和移植受精卵的方法生产。

鸡蛋中的胚胎已经是多细胞胚胎，不适宜用显 微注射法。

到目前为止，美国科学家已用 RSV 载体生产出转基因牛，用 RV 载体生产出转基因鸡。

但这个方法的缺点是对所转移的基因的大小有一定的 限制，同时转移的基因在动物体内表达的问题还没有得到完满解决。

(3)电转移法 电转移法是将生殖细胞或体细胞置于电场内，同时加入待转移的外源基因，在电场作用下外源基因导入细胞内。

近年来，利用电转移 器将外源基因导入小鼠卵中等研究都取得了成功。

这种方法操作比较简单， 效果较好，但不易普及，因为电转移器较昂贵。

(4)胚胎干细胞法 胚胎干细胞是从胚泡中将内细胞团取出在体外培养建 立的，在培养过程中保持了它的正常核型，胚胎干细胞注入寄主胚泡后，能 掺入胚胎，并参与嵌合体动物的生殖系。

利用动物病毒载体法等方法可以将 外源基因导入胚胎干细胞，选出带有目的基因的细胞克隆，然后导入小鼠胚 胎，这就为创造特定的预知转基因动物开拓了一条新途径。

(5)精子载体法 这项工作始于意大利，意大利科学家首先利用小鼠精子 作为载体，使精子与 CAT（氯霉素乙酰转移酶）基因混合，待精子头部吸收 CAT 基因后，用该精子使小鼠卵体外受精，之后移入雌鼠体内。

在出生的 30％小鼠中检出了 CAT 基因。

该方法在青蛙和海胆的实验中也得到了成功。

我 国在这方面进展比较大，自 1989 年以来，北京农业大学与中国农科院畜牧研究所、湖北农科院畜牧兽医研究所和新疆畜科院等单位合作，在家兔、猪、 羊和牛等动物上进行了大量试验，目前已获得了转基因家兔、猪和绵羊。

转 基因效率达到 3％，略高于显微注射的效率。

另外，我国用鱼精子作载体， 把外源人生长激素基因经鲤鱼精子导入鱼卵，表达率为 50％，高表达幼苗生 长速度为不表达幼苗的 2 倍。

我国还成功地进行了用鸡精子导入病毒基因的 实验。

应该说，我国在精子载体法转移基因的研究中，是走在世界前列的。

(6)定位整合技术 转基因动物技术上的最大缺点是盲目性：导入的外源 基因对受体细胞基因组的插入是随机的。

因此，实现外源基因的定位整合技 术（Sitedirected Integration ofGene）以及同期建立的小鼠胚胎多能干细 胞系（ES 细胞系）的体外培养方法，为基因定位整合进而为哺乳动物种系改 造开拓了充满希望的前景。

其大意是利用DNA 体内同源重组的原理，将外源 基因稳定地插入特定的位点，再经适当的筛选，从而得到既定的转化细胞。

这一技术不仅在动物育种上，而且在缺陷基因的修复上（遗传性疾病与恶性肿瘤）以及生命科学的理论研究上，都将有很大的应用价值。

2.向植物体内转移外源基因开展此项研究最早是在 1985 年，之所以比动物转基因晚，除了研究热点 以外，主要是因为植物细胞外有一层细胞壁，这层细胞壁给转基因带来了很 大的不便。

对一个成熟、实用性强的植物转基因系统，它应该具备以下条件：获得转基因植株的效率高；重复性要好；设备要简单，易于操作；由转化至获得 转基因植株的时间相对较短；无基因型的依赖性，即方法的适用范围广，能 在同一个植物种的许多基因型上成功，特别是在优良的栽培品种上成功。

近年来，植物转基因的方法不断有所创新，大体可分为三类。

(1)农杆菌介导的基因转移 根癌农杆菌和发根农杆菌可以使范围很广的 双子叶植物（前者）、也可使部分裸子植物分别形成冠瘿瘤和发状根（hairy root）。

近年已有一些证据显示根癌农杆菌的 Ti 质粒也可向一些单子叶植物（如石万柏、百合、薯蓣等）转移外源基因并表达。

野生型根癌农杆菌的 Ti质粒由于携带与生长素和细胞分裂素合成有关的基因，使转化的细胞产生过 量的植物激素而形成肿瘤。

利用这种野生型农杆菌作为基因载体，常使转化 的细胞丧失分化能力。

利用野生型农杆菌进行转化时，所形成的肿瘤或发状 根本身即是一种天然的选择标记，在无激素的培养基上就可以获得转化细胞 系。

由于发根农杆菌感染后形成的发状根在很多情况下可诱导再生形成植 株，以及发状根本身的单细胞起源，近年利用发根农杆菌进行转化的工作也 已受到不少重视。

根据所用植物材料的不同，常用的农杆菌转化方法大致可 分如下三类：①整株感染——用处于对数生长期的野生型农杆菌感染植物的受伤部 位，将得到的肿瘤或发状根切下，置于含羧苄青霉素的无激素培养基上培养 并杀菌，这是获得转化细胞系的最简便的方法。

这一方法的优点是实验周期 短、操作简便，但在用根癌农杆菌转化形成肿瘤组织时，常混有未转化的正 常细胞，即形成的是嵌合体。

②叶圆片法——该方法用打孔器取得叶圆片或用解剖刀将叶切成小块， 在过夜培养的农杆菌菌液中浸几秒钟到几分钟后，用滤纸吸干后在培养基上 共培养 2～3 天，再转移到含抗菌素的选择培养基上培养并杀菌，再由获得的 转化细胞诱导形成再生植株。

这一方法已广泛用于多种植物的转化。

其他各种外植体，包括茎切段、叶柄、胚轴等以及悬浮培养的细胞均可用类似的方 法进行转化。

例如，在拟南芥上发展起来的利用根切段和萌发种子的转化技 术，已表明有很高的转化频率。

③原生质体和农杆菌共培养法——将处于再生壁时期的原生质体（在原 生质体群体中通常已可见部分已开始第一次分裂）与根癌农杆菌共培养 36～48 小时，分离洗涤去菌后培养在含抗菌素的选择培养基上即可得到转化的细 胞克隆。

与上面两种方法比较，此法得到的转化体一般不会是嵌合体。

利用 这一方法已使多种烟草属植物、矮牵牛、龙葵、胡萝卜等植物的细胞转化， 并获得转基因植物。

共培养法同样适用于发根农杆菌 Ri 质粒的 T-DNA 转移。

在共培养过程中，新形成的细胞壁和一些二价阳离子为农杆菌的附着和转化 所必需。

当由胡萝卜悬浮培养细胞刚分离的原生质体与发根农杆菌混合时并 不形成转化细胞团，发现如果将此混合物放置 2 小时后进行二次电脉冲处 理，则可明显提高转化频率。

(2)以原生质体或细胞作为受体的直接基因转移 直接基因转移，是指经 特殊处理后直接将 DNA 转移到植物细胞或原生质体中导致细胞转化的技术。

常用的 DNA 直接转化技术可分为化学和物理方法两大类。

①利用特定的化合物诱导的 DNA 直接转移——在利用原生质体作为受体 进行外源基因导入的研究中，已发现一些化合物有助于原生质体摄取外源 DNA，包括 PEG（聚乙二醇）、PLO（聚-L-鸟氨酸）、磷酸钙等。

聚乙二醇法 是将原生质体悬浮于含有 DNA 的介质中，用分子量为4000～6000 的 PEG 在 pH8～9 下促进 DNA 的摄取，从而使细胞转化。

很多因素都会影响 PEG 诱导的 转化，如加入 DNA 和 PEG 的次序，是否加入了携带 DNA（carrier DNA），导 入的 DNA 的形式如何，加入的 PEG 的最终浓度多少等。

用经同步化处理后的 烟草叶肉原生质体，已发现在细胞周期的 S 期或 M 期时的转化频率明显高于 其他时期，在用 PEG 处理前用低剂量的 X 射线或紫外线处理原生质体，可使 抗性细胞团增加 2～7 倍，而不影响细胞团的形成和植株再生，这可能是因多 辐射使更多的细胞有效地整合外源基因。

其他一些因素，如保温处理的时间， 在加入 DNA 之前对原生质体的热休克处理等也有一定的影响。

至今，利用 PEG 法已使多种重要的禾谷类作物，如水稻、高粱、小麦的原生质体获得了基因植物。

②利用物理方法诱导的 DNA 直接转移——这类方法的原理是基于许多物 理因素均可通过对细胞膜的影响，促进外源 DNA 分子进入细胞，或通过机械 损伤后直接将外源 DNA 导入细胞。