质粒pKN402的复制起始位点是耐温型的，在42C时仍然 有很强的复制起始的功能。
电泳后回收片段c
电泳后回收片段1和3 连接
温度对3种表达载体质粒拷贝数的影响
由于pKN402和pCP3的复制子在42C时仍然具有很强的起 始复制能力，因此当培养温度升高到42C时，细胞中的 pKN402和pCP3的拷贝数要比pPLc2833高5～10倍。
Ptac 启动子：
是来自于lac和trp的一组杂合启动子，但是比lac和trp都强 得多，是一组强启动子。包括：
（1） PtacI：PlacUV5的-10区 ＋ Ptrp的-35区； （2） PtacII：Ptrp的-35区（一段合成的包括Pribnow框在
内的46bp的DNA） ＋ Plac的操纵基因； （3） Ptac12：Plac的-10区 ＋Ptrp的-35区
trp promoter色氨酸启动子 由色氨酸阻遏蛋白进行调控：正调控作用。可 形成启动子-阻遏蛋白复合物。
trp 启动子的脱阻遏可通过：
（1）移除色氨酸； （2）加入色氨酸结构类似物，如吲哚丙烯酸（ 3indoleacrylic acid）. 3’--吲哚丙烯酸
trpR 阻遏蛋白 Trp
色氨酸操纵子（trp operon）
第二章 原核微生物的基因表达与操作
2.1 原核微生物的基因表达及其调控 2.2 原核微生物的基因表达产物的分离纯 化
第一节 原核生物的基因表达与调控因素
（1）转录因素； （2）翻译因素； （3）蛋白质的稳定性； （4）胞外分泌的特性
一、原核生物的基因表达
（一）、转录对基因表达的影响
新生RNA序列与模板链 互补；与编码链相同。
（1）为pBR322衍生质粒，插入 了强启动子PlacUV5并在其下 游加入了-半乳糖苷酶的 编码序列（ -gal）21 bp 片断和一个EcoRI位点；
（2）其融合蛋白的N端为-半乳 糖苷酶的前7个氨基酸和 EcoRI接头编码的少数几个 氨基酸，其C端为完整的外
源蛋白。
2、含trp 启动子的表达载体：
（四）大规模培养系统
小规模培养（1～5L）含表达载体的重组菌株时，其调控可以直 接向培养基中添加诱导物，或者升高温度，但是在半工业化（20～ 200L）或者工业化大规模（大于200L）生产时，不能采用小规模的 方法：
（1）直接向培养基中添加诱导物如IPTG，由于需要量较大，成本 高，不经济；
（2）即使是使用温度敏感的表达载体，升高温度既需要较长的时 间，又需要很大的能源消耗，成本也很高。
-半乳糖苷酶在不同受体菌中的表达：
携带包含大肠杆菌 lacZ 基因和异源启动子的质粒载体的不同革兰氏阴性菌
受体菌中测定的-半乳糖苷酶活性
Promoter
-Galactosidase activity (U) in:
Escherichia Rhizobium
Rhizobium
Pseudomonas
coli
子T1和T2，以避免其它 基因的过度转录。
4、含PL 启动子的表达载体：
是一种极强的启动子，所以被广泛用于各种载体的 构建； 如：pPL-; （1）来源于pBR322, pBR322的EcoRI/BamHI位点
被PL 和N基因取代； （2）外源基因可以插入到N基因中的HpaI位点； （3）当培养温度为29-31C时，PL启动子处于阻遏
meliloti
leguminosarum
putida
None
16
110
130
150
Nm
1,400
21,800
13,900
16,300
lac
2,000
9,050
6,250
9,800
tac
11,300
2,850
1,150
2,950
S1
40
3,300
1,200
3,350
大肠杆菌
苜蓿根瘤菌
豌豆根瘤菌
恶臭假单胞菌
3、含tac 启动子的表达载体：
高表达效率启动子；受IPTG的诱导。 多种商业化的载体。如： pKK223-3; pBADHis-A, B, C; pTrcHis-A, B, C; pSE420
特点：
1）Ampr； 2）tac启动子； 3）lacZ核糖体结合部位； 4）ATG起始密码子，位于
RBS下游8bp处； 5）来源于-噬菌体的终止
所有Ptac都受IPTG的诱导，同时受到阻遏蛋白的阻遏调控。
PL 启动子：
阻遏蛋白: cI，来源于噬菌体 . cI857 : 为 cI温度敏感突变体. (1) 将携带敏感的cI857 的细菌细胞首先在28 to 30C条件下
培养，此时cI857 阻遏PL启动子的转录； (2) 当细菌细胞被培养至特定浓度时（一般是到达平衡
一种解决的途径：使用“双质粒系统”：用trp启动子带动编码cI阻遏 蛋白的基因，然后将它们置于一个弱启动子的载体上；将要表达的外源基 因置于强启动子PL之下，使其受PL启动子的控制。
A 培养基中不存在色氨酸
cI蛋白合成 （脱阻遏）
B 培养基中存在色氨酸
cI蛋白不合成 （阻遏）
无克隆基因蛋白 合成（阻遏） “双载体系统”特点：
-半乳糖苷酶在不同受体菌中的表达分析：
(1) 所有启动子在受体菌中都有一定的活性； (2) tac启动子在大肠杆菌中活性最高，但是在其它 受体菌中活性最低； (3) 新霉素基因启动子（Nm）是在大肠杆菌中活性 最低的启动子，但是在其它受体菌中驱动转录的活性 却最高。
广 宿 主 载 体
4) 启动子（A promoter）;
9) 转录起始位点 (Startsite);
5) 终止子（A terminator）;
10) 初始转录产物 A primary transcript
RNA聚合酶 可形成1个中 间管道
(二)、原核生物基因的翻译
起始因子Initiation factors (IFs) 可稳定自由状态的 30S 亚基；以及结合起始 tRNA 到 30S-mRNA复合物上
（2）容易被大肠杆菌的RNA聚合酶全酶所识 别。
四种简单类型控制通路
诱导作用是指存在诱导 物能使阻遏蛋白失活，或 者可激活一个激活蛋白而 解除阻遏蛋白对转录起始 过程的阻遏；
阻遏作用是指一个辅阻 遏物激活一种阻遏蛋白， 或者使一种激活蛋白失活 而对转录过程发生阻遏作 用。
： lac 启动子
（1）lac启动子来源于大肠杆菌的乳糖操纵子，包括启动子、 活化蛋白（catabolite activator protein, CAP）结合位点、操 纵基因和lacZ组成。 （2） lac启动子受到阻遏蛋白（repressor）的负调控，而受到 CAP和cAMP的正调控。其中CAP的正调控是通过增加启动子 与RNA聚合酶的亲和性而起作用。 (3) lac 启动子由于与阻遏蛋白相结合而处于关闭状态，但当 加入乳糖或者半乳糖苷结构类似物，如异丙基硫代半乳糖苷 （IPTG）、硫甲基半乳糖苷（TMG）和邻硝基苯基半乳糖苷 （ONTG）后可发生脱阻遏作用。
期），将培养温度升高至42C, 此时cI857 不再发生阻 遏作用，PL启动子开始启动转录过程。
PL 启动子
噬菌体左向操纵子结构示意图 PL为噬菌体左向早期启动子，控制基因从N到att的早期转录，受 到cI所编码的阻遏蛋白的调控。
优良表达载体的性能
（1）强转录启动子和终止子； （2）核糖体结合位点（RBS）的强弱； （3）质粒载体及其质粒的拷贝数；是否整合到来自pOP203-13特点
表达载体pOP203质粒结构示意图
pOP203系列表达载体：A family of cloning vectors containing the lacUV5 Promoter
pOP203-1,2,3、pOP203-13、pOP203-24、 pOP203-27、pOP203-28、pOP203-29
乳糖操纵子基因产物:
1) lacI: 阻遏蛋白; 2) lacZ：-半乳糖苷酶； 3) lacY：透性酶; 4) lacA：硫代半乳糖苷转乙酰基酶
cAMP参与乳糖操纵子的调控：
（1）cAMP通过与cAMP受体蛋白（CRP）结合，引起CRP构 象变化，形成一种有活性的cAMP-CRP复合物；
（2）乳糖操纵子启动基因（O）有2个位点：一个与RNA聚合 酶结合；另一个与cAMP-CRP结合，而且只有后者结合 后才能与启动基因结合，启动转录过程；
（1）产生的表达蛋白的量高于lac启动子；
（2）所有含trp启动子的表达载体都受到3--吲哚丙烯
酸（IAA）的诱导。
如：pDR720
质粒载体pDR720结构示意图
质粒pDR720是一个含trp启动子的表达载体，它 来源于p51，trp启动子在Sma I位点插入，在启动子 的下游有3个位点，Sal I、BamH I和Sma I，可以插 入外源基因。
要注意的关键名词术语:
1) 编码链（有义链，the coding strand）; 6) 转录单位（A transcription unit）;
2) 反义链（模板链，the template strand）; 7) 上游（Upstream）;
3) RNA聚合酶（RNA polymerase）;
8) 下游（Downstream）;
E. coli用作受体菌的优势：
（1）对其遗传学背景、分子生物学、生物化学和生 理学方面的了解较为深入；
（2）很多目的基因能在E. coli中迅速而有效地表达；
（3）其培养条件易于掌控，培养费用相对较低。。
非调控启动子：对细胞产生伤害 (1) 持续性地高水平表达某一目的基因会过分消耗宿
主细胞的营养和能源，最终造成致死效应;
(2) 由于使宿主细胞处于生长的逆境，容易发生载体 质粒的丢失；