细胞RNA提取
5. 洗涤：
将吸附柱置于一个新的无RNase离心管（CollectionTube1.5ml）中向吸附柱的 中间部位加入30-50μl• RNase-FreeWater，室温放置1min，12,000rpm离心1min， 收集RNA溶液，进行后续试验或-70℃保存RNA，防止降解。• 注意：1）RNase-FreeWate体积不应小于30μl，体积过小影响回收率。 • 2）若提高RNA的产量，可用30-50 μl新的RNase-FreeWater重复步骤5。 • 3）若提高RNA浓度，可将得到的溶液重新加入到吸附柱中，重复步骤5。•
人cDNA RNase-Free Water
0 μl 57.6 μl
2 μl 7.2 μl
3. 将配制的预混体系，分装到八连管中。共加6个孔，每个孔中加 入18 μl的预混体系。
荧光定量PCR
4. 模板加入：
每个孔中分别加入2 μl模板，加样顺序如下：
加样孔 样品 1 原液 2 稀释10倍 3 稀释100 倍 4 稀释1000 倍 5 稀释10000 倍 0 水
6. RNA检测：
用ddH2O，对仪器进行调零；取1ul的RNA溶液进行测定；
测定样品纯度和浓度。
纯度：OD260/OD280 = 1.9-2.1 <1.8 蛋白质或酚类污染 >2.2 RNA水解 浓度：RNA(ug/ml)=40﹡OD260*稀释倍数
逆转录
实验材料：HiFi-MMLV cDNA第一链合成试剂盒，RNA 实验步骤：
荧光定量PCR
北京康为世纪生物科技有限公司
细胞RNA提取
样品：293T细胞 试剂：超纯RNA提取试剂盒、氯仿、70%乙醇 方法：柱式
原理：
• • 细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放。 释放出来的DNA和RNA由于在特定pH和盐浓度下溶解度的不同而分别位于整个 体系中的中间相和水相，从而得以分离。
Thank You !
加入体 积
2 μl
2 μl
2 μl
2 μl
2 μl
2 μl
5. 混匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。 6. PCR反应程序：
步骤 预变性 变性 退火/延伸 融解曲线分 析 温度 95℃ 95℃ 60℃ 95℃ 60℃ 95℃ 60℃ 时间 10min 15s 1 min 15s 1 min 15s 15s 注意事项： 1．首先配制预混体系，再将预混体系分 装到八连管中。 2. 稀释模板时，需要混匀。 不要直接在八连管管壁或管盖上做标
原液 5 μl （从1号管取） 5 μl（从2号管取） 5 μl（从3号管取） 5 μl（从4号管取）
6
45ul
对照
荧光定量PCR
2. 配制PCR预混反应体系：
做5个样本，配制8个样本的预混体系，配制方式如下：
试剂 2×UltraSYBR Mixture Forward Primer，10 µ M Reverse Primer，10 µ M 配制的8个孔的预混 体系 80 μl 6.4 μl 20 μl反应体系 10 μl 0.8 μl
材料：2×UltraSYBR Green Mixture，cDNA，actin引物
实验步骤：
1. 稀释模板：每稀释一个倍数，需要将溶液混匀，并短暂离心。
编号
1 2 3 4 5
模板稀释 倍数
1倍 10倍 100倍 1000倍 10000倍
水用量
0ul 45 μl 45 μl 45μl 45 μl
模板用量
细胞RNA提取
3. 过柱子：
吸取上层水相，至新的RNase-Free管中（注：不要吸到中层） 加入等体积70%的乙醇，颠倒混匀； 将溶液全部加入到已装入收集管（CollectionTube 2ml)的吸附柱 （Spin• Column RM）中。若一次(700ul)不能加完溶液，可分多次入； 12,000rpm离心20s，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中；
1. 将 RNA模板、Primer Mix、dNTP Mix、DTT、RT Buffer、HiFi-MMLV和
RNase- Free Water溶解并置于冰上备用。
2. 根据以下表格配置反应体系，总体积为20 μl。
试剂 dNTP Mix，2.5 mM Each Primer Mix RNA Template 5×RT Buffer DTT，0.1 M HiFi-MMLV，200 U/μl RNase-Free Water 20 μl 反应体系 4 μl 2 μl 2 μl 4 μl 2 μl 1 μl 5 μl
4. 洗涤：
向吸附柱加入700 μl Buffer RW1，12,000rpm离心20s，倒掉收集管中的废液， 将吸附柱重新放回收集管中； 向吸附柱中加入500μl• Buffer• RW2（使用前检查是否已加入无水乙醇）， 12,000rpm离心20s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中； 重复步骤8；12,000rpm离心2min，弃废液，吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干；
冰上配制 短暂离心
42℃ 50min 70℃ 15min
逆转录
3. 涡旋震荡混匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。
4. 42℃孵育3Байду номын сангаас~50分钟，70℃孵育15分钟。反应结束后，短暂离心，置于
冰上冷却。 5. 逆转录产物可直接用于PCR和荧光定量PCR，或置于-20℃长期保存。
荧光定量PCR
细胞RNA提取
1. 裂解： 细胞悬液离心，倒掉上清，加入1ml RLT； 反复吹打，使样本充分裂解； 室温放置5min，使核酸蛋白复合物完全分离 2. 抽提： Ø 加入200ul氯仿，剧烈振荡15s，室温放置2min； Ø4℃ 12,000 rpm 离心10分钟，此时样品分为三层； 上层无色水相， 中间白色蛋白质相， 下层红色有机相， RNA在上层水相中