等）； ➢ ➢ 蛋白质提取（根据物质的性质，水、盐溶液、稀酸、稀碱、有
机溶剂）； ➢ 蛋白质分级分离（盐析分级分离、有机溶剂分级分离、等电点
分离）； ➢ 进一步纯化（透析、柱层析：分子筛、离子交换、亲和层析、
HPLC）； ➢ 鉴定（电泳：薄层电泳（纸，NC膜）、凝胶电泳（PAG，琼脂，
淀粉）；结构分析；活性分析；呈色反应）； ➢ 含量测定（fonlin酚法、考马斯亮蓝G250法）。
SDS PAGE电泳法：测定亚基数 超速离心：成分均一 其它：如, 结晶法……
蛋白质分级分离方法(粗分级)
一、盐析 二、有机溶剂沉淀 三、选择性沉淀法(等电点、热变性、酸碱变性等) 四、吸附法 五、重金属盐沉淀法
蛋白质的进一步纯化(细分级)
一、透析和超过滤 二、层析(色谱,Chromatography)分离 1.气相色谱(色谱仪) 2.液相色谱：纸层析和薄层层析（分配层析）、柱
实验三
蛋白质的盐析分离和凝胶层析脱盐
【实验目的与要求】
(1)了解蛋白质提取、分离、纯化及鉴定技术； (2)学习蛋白质的盐析分级分离原理； (3)学习蛋白质凝胶层析分离原理。
蛋白质提取、分离、纯化及鉴定技术
➢ 材料（取材一定要新鲜，在低温下操作）； ➢ ➢ 破细胞（匀浆器，研钵，超声波，反复冻融，化学方法，酶解
液。 ➢ 为什么不用氯化钡？因为氯化钡易同蛋白质形成
沉淀。 ➢ 记录结果：
1 23 4 5 6 789 - - + +++ ++ + - - -
思考题
1. 蛋白质的沉淀作用还有哪些方法？哪些是 变性了？哪些没有变性？在分离蛋白质时 常使用哪些方法？
2. 柱层析有哪些种类？其分离物质的基本原 理？
预习实验四
凝胶层析
大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排阻在外，只 能沿着颗粒间的缝隙流出柱外（所用洗脱液的体积为 外水体积）；而小分子不被排阻，可自由扩散，渗透 进入凝胶内部的筛孔，尔后又被流出的洗脱液带走 （所用洗脱液的体积为内水体积）。分子越小，进入 凝胶内部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出 柱外，而大分子先从柱中流出。这样样品经过凝胶层 析后，分子便按照从大到小的顺序依次流出，达到分 离的目的。
A280
3、ＵＶ检测蛋白质
蛋白质脱盐洗脱曲线 6 5 4 3 2 1 0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 洗脱液（ml)
蛋白质洗脱曲线记录方式
4、盐离子的检测
➢ 用醋酸钡检测溶液中的硫酸根离子。 ➢ 灵敏度高，与溶液中的硫酸根离子可以形成白色
的沉淀。同时不能同蛋白质形成沉淀。 ➢ 实验中要设对照，即加入双蒸水和醋酸钡检测溶
➢ SephadexG-25粗：吸水量2.5ml/g，干粒子直径100300µm，筛孔40-60。大部分蛋白质分子从外水体积 流出，盐等小分子从内水体积流出。
【实验内容与操作】
1、蛋白质（卵球蛋白）的盐析分级分离； 2、蛋白质（卵球蛋白） SephadexG-25脱盐； 3、ＵＶ检测蛋白质； 4、盐离子的检测。
蛋白质的定量测定：考马斯亮析法
有机溶剂沉淀法
层析法
电泳法
电学法 等电聚焦
离子交换层析 吸附层析 凝胶过滤（分子筛） 亲和层析……。
超速离心法
纯度、Mw 和pI测定
层析法：凝胶过滤;高效液相色谱法 电泳法：PAGE、梯度凝胶电泳、等电聚焦电泳等 免疫化学法：专一的沉淀线
层析（分子排阻、离子交换、亲和层析、吸附层 析等） 3.高效液相色谱（色谱仪）
谢谢欣赏
THANK YOU FOR WATCHING
1、蛋白质（卵球蛋白）的盐析分级分离
2、蛋白质（卵球蛋白） SephadexG-25脱盐
2.5
10管
ml
注意事项
➢实验完毕后，将凝胶全部回收处理，以备下次 实验使用，严禁将凝胶丢弃或倒入水池中； ➢样品溶液的浓度大一些好，但粘度不宜大，加 样体积通常为凝胶柱床体积的1%-10%； ➢洗脱用的液体与凝胶溶涨和凝胶平衡时所用的 一样； ➢ 洗脱速度要恒定； ➢凝胶暂时不用时，要加防腐剂（如0.02%叠氮 化钠溶液）； ➢ 再次使用凝胶时可再生后使用。
【实验原理】
蛋白质的盐析
用大量中性盐使蛋白质从溶液中析出的过程称为蛋白 质的盐析作用。蛋白质是亲水胶体，在高浓度的中性 盐影响下脱去水化层，同时，蛋白质分子所带的电荷 被中和，结果蛋白质的胶体稳定性遭到破坏而沉淀析 出。经透析或用水稀释时又可溶解，故蛋白质的盐析 作用是可逆过程。分子量大的蛋白质（如球蛋白）比 分子量小的（如白蛋白）易于析出。改变盐浓度，使 不同分子量的蛋白质分别析出。
凝胶层析又称排阻层析，凝胶过滤，渗透层析或分子筛层析等。
凝胶层析载体
➢ 用作凝胶的载体物质有交联葡聚糖、聚丙烯酰胺和琼 脂糖等。使用最多的是交联葡聚糖。
➢ 交联葡聚糖的商品名为Sephadex,是由链状葡聚糖通 过交联剂1—氯代—2，3—环氧丙烷交联而成。交联 剂添加越多，孔径越小，吸水量也越小；反之越大。 以G-x表示型号，后面的数字可以看出交联度，数字 越小，胶联度越大。