指纹图谱中,保留时间在15～65min的12～36号色
谱峰峰形及相对比例较稳定,体现了红花的共同特征； 而保留时间在0～15min的1～11号色谱峰则变化较多, 是不同药材的差异所在。 商品红花指纹图谱的主要差异集中在4,5和6号峰的
峰形及其相对高度上。新疆主产地红花指纹图谱,主要
差异集中在2,3,4,5,6,8和9号峰的峰形及其相对高度 上。
实例一
红花高效液相色谱指纹图谱研究
红花为菊科红花的花，活血化瘀中药，有效成分 为查耳酮类和黄酮类成分，其中羟基红花黄色素Ａ为 主要有效成分之一。主产地新疆。红花药材指纹图谱 研究主要针对查耳酮类和黄酮类成分，以新疆主产区 药材为主要研究对象。
1.实验材料
样品 红花采自新疆、内蒙古、陕西、河南、安 徽等地，共31份样品，均经品种鉴定。 对照品 羟基红花黄色素Ａ，实验室自制。
4.测定法
取参照物及供试品溶液各 20µ l, 注入液相色谱仪， 按选定的测试条件，测定并记录色谱图。
5.方法学考察
(1)稳定性试验： 取供试品溶液，室温下放置，分 别在 0 、 1h 、 2h 、 3h 、 4h 、 5h 、 24h 、 48h 不同时间点进
行检测，经计算机辅助相似度评价软件计算，结果相似
Chebulamin，13号峰为诃黎勒酸,15号峰为诃子酸。
指纹图谱特征峰基本是酚酸类成分，高保留成分为 没食子酸等。这含药材鞣质类成分高达3.5％相符。
试剂 乙腈（美国 Tedia 公司，色谱纯）、重蒸 去离子水（实验室制备）、磷酸（分析纯）
2.溶液制备
供试品制备 取样品粉末 ( 过 4 号筛 )2.0 ｇ , 精密称 定,置具塞三角瓶中,加水50ｍL,称重,90℃水浴中提取 1ｈ,称重,补足减失重量,滤过,精密量取续滤液10ｍL, 微孔滤膜滤过,作供试品。 参照物制备 精密称取羟基红花黄色素Ａ对照品 适量,加水制成0.2ｇ/L的溶液，作参照物。
度为0.9823～0.9993，表明样品在测定的48h内稳定。
(2) 精密度试验： 取供试品溶液，连续进样 5 次，
各色谱峰保留时间的相对标准偏差RSD均低于3%。 （ 3 ）重现性试验： 取同一批次样品，依法制得 5 份供试品液，平行测定，各色谱峰保留时间的 RSD 均低 于3%。经相似度评价其相关系数大于 0.9929，表明本法
同构成第Ⅰ区特征。第Ⅱ区(6～11号), 共有特征是6、
7 、 11 号峰表观丰度呈递增趋势，丰度较小的 8 、 9 、 10 号峰构成西青果的突出特点。第Ⅲ区（12～15号），特 征峰最突出的是 13 号峰（诃黎勒酸）， 12 号峰 <<<13 号 峰>>>14号峰<<15号峰。
共有指纹峰面积比
除诃黎勒酸参照物峰外， 7 、
除参照物峰以外，无共有指纹
峰面积（峰）超过总峰面积的10%。 各地商品红花的指纹图谱, 采用“计 算机辅助相似度评价系统”软件进行数据处理,结果样 品a～n的相似度分别为0.96,0.78,0.88，……0.93。
新疆动
新疆主产地, 不同红花药材的指纹图谱相似度
较高（均>0.90)。尤其是吉木萨尔县红旗农场——红花 栽培基地的红花指纹图谱相似度更高（多>0.95)。
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测定的重现性良好。
6.指纹图谱建立
根据 10 批次供试品测定结果所给出的峰数、峰值 （A）和峰位（tR）等相关参数，进行分析、比较，制定
优化的指纹图谱。
13 1 5 11
诃黎勒酸 tR=29.3′
没食子酸tR=5.6′
3 7
6
8 9 10
诃子酸 15 tR=33′
12
14
2
4
图3-42 西青果HPLC指纹图谱
0.760、0.779、0.808、0.947、1.028、1.122。
13 1 5 11
诃黎勒酸tR=29.3′
没食子酸tR=5.6′
3 7
诃子酸tR=33′
15 6 8 9 2 4
10
12 14
图3-42 西青果HPLC指纹图谱
共有指纹峰特征
整个色谱图分成3区段。第Ⅰ区
(1～5号),主峰为1、3、5号峰，其表观丰度呈1号峰>>3 号峰（没食子酸）<<<5号峰；2号、4号峰为极弱峰，共
的微孔滤膜,滤液作为参照物。
3.色谱条件
色谱柱 LiChrospher 分析柱 RP-18 （4×125mm； 5mm）；预柱：Phenomenex C18。
流动相 0~5min
三元梯度洗脱： A.0.05M的磷酸液与0.05M B（％）6~3
B（％）3~2 B（％）2~6 B（％）6~40
的磷酸二氢钾液（1:1）；B.甲醇；C.醋酸乙酯。
3.色谱条件与系统适用性试验
Waters600 型高效液相色谱仪 ,2996 二极管阵列检 测器, Waters Millenium色谱工作站；
色谱柱为 Phenomenex Luna (250mm 4.6mm ID, 5µ m)； 乙腈-0.5%磷酸为流动相梯度洗脱，运行时间65min；
柱温25℃； 流速1.0mL/min； 检测波长275nm。
重现性试验： 取同一批次样品，按上法分别制 备 5 份供试品，测定，用“中药指纹图谱相似度计算 软件”计算，结果相似度均大于0.95，表明本法测定 的重现性良好。
供试品测定
同一上述实验条件下，测定 10 批次
供试品HPLC色谱图。
5.指纹图谱的分析与评价
根据 31 批次供试品测定结果所给出的峰数、峰值 （积分值）和峰位（相对保留时间）等相关参数，进 行分析、比较，制定优化的指纹图谱。 红花高效液相色谱可分离出约 50 多个色谱峰，经 与参照物对照以及比较所有测定和记录的色谱图，选 取其中36个共有峰作为指纹图谱的特征峰。
试剂 仪器
醋酸乙酯、甲醇、丙酮、甲醇、磷酸、磷酸 Agilent 1100液相色谱仪，DAD检测器。 取样品粉末（3号筛）各0.05g，用丙
二氢钾（均为分析纯）,重蒸去离子水（实验室制备）。
2.溶液制备
供试品制备
酮热回流 2 次（ 50ml/30min ），过滤，滤液蒸干，残渣
用水做成10ml，冰箱放置约1h，取出，通过孔径0.45µ m 的微孔滤膜,滤液作为供试品。 参照物制备 取没食子酸、诃黎勒酸、诃子酸对照 品,用30%甲醇分别做成50mg/ml的溶液,通过孔径0.45µ m
进样量：供试品及参照物各20µ l。
4.测试方法
取待测溶液适量 , 注入液相色谱仪，按选定的测 试条件，测定色谱图。并进行实验方法学考察。
流动相选择 经实验比较，乙腈 -0.5% 磷酸溶液 梯度洗脱，能较好地使样品中各色谱峰分离且出峰最 多；分析时间 65min ，样品 1.5h 图谱显示， 65min 后无 特征峰出现。
实例二 西青果高效液相色谱指纹图谱研究
西青果为使君子科诃子或绒毛诃子的幼果。诃子含 鞣质类、三萜类、酚酸类等成分。其中没食子酸、诃黎
勒酸、诃子酸等鞣质为主要化学成分，含量高达 23 ～
37%。西青果传统来源主要从印度及斯里兰卡进口。
1.实验材料
样品 共42个样品，均为各地市场商品（包括进 口样品），绝大多数为进口药材收载的诃子 Terminalia chebula Retz.的幼果。 对照品 没食子酸、诃黎勒酸、诃子酸由中国药 品生物制品检验所提供，供含量测定用。
A：乙腈，B：0.5%磷酸溶液
0—55min
55—65min
A（％）0—25
A（％）25—0
B（％）100—75
B（％）75—100
方法学考察 稳定性试验： 取同一批次供试品， 在室温下放置，每隔一定时间进样后，测定，用“中 药指纹图谱相似度计算软件”计算，结果相似度均大 于0.95，表明供试品在测定的24h内保持稳定。 精密度试验： 取同一批次供试品，连续进样5次， 考查进样精密度，用“中药指纹图谱相似度计算软件” 计算，结果相似度均大于0.95，表明供试品进样精密 度良好。
A（％）94~96
C（％）0~1
C（％）1~5 C（％）5~5 C（％）5~5
5~15min A（％）96~93 15~20min A（％）93~89 20~35min A（％）89~55
流 柱
速 温
1.0ml/min； 20℃； 280nm；
检测波长
分析时间
进样量
40min；
供试品及参照物各20µ l。
羟基红花黄色素Ａ
共有指纹峰标定
根据10批次供试品测定结果，标
定共有指纹峰。红花 HPLC 指纹图谱中，共有指纹峰 36 个。与羟基红花黄色素Ａ参照物峰（ 22 号峰）相比， 其它 35 个共有指纹峰相对保留时间依次为： 0.11 、 0.17、0.20……1.84、2.03。
共有指纹峰面积比
相似度评价
7.西青果指纹图谱分析与评价
西青果高效液相色谱可分离出约20多个色谱峰，经 与参照物对照以及比较所有测定和记录的色谱图，选取
其中15个共有峰作为指纹图谱的特征峰。
共有指纹峰标定 根据10批次供试品测定结果，标 定共有指纹峰15个。与诃黎勒酸参照物峰（13号峰）相 比，其它 14 个共有指纹峰相对保留时间依次为： 0.080 、 0.131 、 0.189 、 0.237 、 0.344 、 0.475 、 0.595 、 0.674 、
11号峰共有指纹峰面积超过总峰面积的 10%,规定相对峰 面积比值：7号峰为0.24～0.44,11号峰为0.24～0.45。
8.西青果液相色谱指纹图谱主要色谱峰的光谱 特征及LC/MS鉴定
利用高效液相色谱的在线DAD检测器,测定主要色谱
峰的光谱，给以定性鉴别的信息。