中国临床康复第１０卷第２８期２００６－０７－２５出版ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＲｅｈａｂｉｌｉｔａｔｉｏｎ，Ｊｕｌｙ２５２００６Ｖｏｌ．１０Ｎｏ．２８实验性自身免疫性重症肌无力模型的制备☆杨春晓，王化冰，王维治・研究快报・哈尔滨医科大学附属第二医院神经内科，黑龙江省哈尔滨市１５００８６杨春晓☆，女，１９７２年生，黑龙江省哈尔滨市人，汉族，２００５年哈尔滨医科大学毕业，博士，副主任医师，主要从事神经免疫学方面的研究。
中图分类号：Ｒ７４６．１文献标识码：Ａ文章编号：１６７１－５９２６（２００６）２８－０１１６－０２收稿日期：２００５－１２－０２修回日期：２００６－０４－１７（０５－９９－８－６０４７／Ｇ）杨春晓，王化冰，王维治．实验性自身免疫性重症肌无力模型的制备［Ｊ］．中国临床康复，２００６，１０（２８）：１１６－７［ｗｗｗ．ｚｇｌｃｋｆ．ｃｏｍ］摘要目的：建立一种模拟人类重症肌无力的动物模型。
方法：①主动免疫：多采用大鼠和小鼠，将免疫原乙酰胆碱受体与福氏完全佐剂混合制成抗原乳剂后用于动物免疫。
免疫大鼠的抗原乳剂为２００μＬ。
小鼠需要在首次免疫后的第５～８周进行２次或３次的追加免疫，每次剂量为１００μＬ。
②被动免疫：分离重症肌无力患者外周血提取淋巴细胞，将包含（２．０～２．５）×１０７淋巴细胞的磷酸盐缓冲液０．３ｍＬ腹腔注射于免疫严重联合免疫缺陷小鼠，在其血液中产生人类的抗乙酰胆碱受体抗体。
免疫后的小鼠不能产生类似于临床上重症肌无力的体征，其表现需要通过肌松药泮库溴铵（ｐａｖｕｌｏｎ）予以检测。
腹腔注射０．０３ｍｇ／ｋｇｐａｖｕｌｏｎ后，令小鼠上肢抓握一横梁，处于悬空状态，正常小鼠抓握的时间在１０ｍｉｎ左右。
结果：①主动免疫：大鼠在首次免疫后即可表现出急性期、缓解期和慢性期等典型的３阶段重症肌无力病程。
其慢性期的表现更符合人类重症肌无力。
而小鼠表现出一种缓慢进展的发病过程，大多数小鼠（９０％左右）在追加免疫后７～１４ｄ发病。
②被动免疫：免疫后严重联合免疫缺陷小鼠抓握的时间短于１０ｍｉｎ。
结论：经以上方法诱导出的实验性自身免疫性重症肌无力动物模型，有助于为重症肌无力的病因、病理分析及临床药物治疗提供实验学依据。
主题词：重症肌无力，自身免疫性，实验性／病理学；疾病模型，动物０引言目前普遍认为重症肌无力是Ｔ细胞依赖、补体参与及自身抗体介导的器官特异性自身免疫病。
实验性自身免疫性重症肌无力是模拟人类重症肌无力的一种动物模型，为临床分析重症肌无力的病因、病理和治疗提供了基础。
１主动免疫的实验性自身免疫性重症肌无力动物模型１．１动物种系的选择现多采用大鼠和小鼠。
其中大鼠对实验性自身免疫性重症肌无力的易感性强弱程度依次递减为Ｗｉｓｔａｒ＞Ｍｕｎｉｃｈ＞Ｆｉｓｃｈｅｒ＞Ｌｅｗｉｓ＞Ｂｕｆｆａｌｏ＞Ｂｒｏｗｎ＞Ｎｏｒｗａｙ＞ＡＣＩ＞ＷａｔａｒＫｙｏｔｏ＞Ｋｏｐｅｎ－ｈａｇｅｎ＞ＷａｓｔａｒＦｕｒｔｈ；小鼠中单倍型Ｈ－２ｂ系对实验性自身免疫性重症肌无力有高度易感性，Ｈ－２ｑ系中度易感，单倍型Ｈ－２ｋ和Ｈ－２ｐ系相对抵抗。
其中对实验性自身免疫性重症肌无力的易感性以小鼠Ｃ５７ＢＬ／６，ＳＪＬ和ＡＫＰ较高，发病率在５０％～７０％，其他种系如ＳＷＲ，ＢＡＬＢ／ｃ和Ｃ３Ｈ／Ｈｅ易感性低，仅为０％～１５％。
１．２抗原免疫原乙酰胆碱受体自加利福尼亚电鳗中提取和纯化，将它与福氏完全佐剂混合制成抗原乳剂后再用于动物的免疫。
福氏佐剂为非特异性的免疫增强剂，可以增强和扩大免疫应答的效果。
在抗原乳剂中，免疫大鼠的抗原乳剂为２００μＬ，其中含乙酰胆碱受体５０μＬ；小鼠一般需要２次或３次的追加免疫，每次剂量为１００μＬ，其中含乙酰胆碱受体２５μＬ。
追加免疫常在首次免疫后的第５～８周。
免疫的常见部位为６个皮下注射点，它们包括后背、后足跖以及尾的起始部。
实验中作者常选择后背４个点作为首次免疫部位，后足跖为追加免疫部位。
１．３模型的诱导大鼠在首次免疫后即可表现出急性期、缓解期和慢性期等典型的３阶段病程。
作者以Ｌｅｗｉｓ为实验动物，观察发现急性期平均出现在致敏后第７，８天，约７ｄ后症状逐渐消失，而后进入持续约１０ｄ的缓解期，慢性期平均出现在致敏第２７天，此后症状不再缓解，未经治疗的大鼠症状会逐渐加重，甚至死于无力咀嚼引起的体质量减轻、衰竭或呼吸困难。
大鼠的急性期症状持续时间短暂，且能够自发缓解，其慢性期的表现更符合人类重症肌无力，也更适用于重症肌无力的研究。
小鼠与大鼠不同，没有急性期和缓解期，而是表现出一种缓慢进展的发病过程。
大多数小鼠（９０％左右）在追加免疫后７～１４ｄ发病，而在一些高敏感性的种系如Ｃ５７ＢＬ／６和ＳＪＬ中，个别小鼠可在首次免疫后三四周出现无力或瘫痪。
１．４模型的评估在首次（大鼠）和追加免疫后（小鼠）隔日对动物进行评分，观察实验性自身免疫性重症肌无力特有的肌无力的体征。
大鼠症状分３级：０级没有肯定肌无力的表现；１级休息时肌力正常，但在连续２０次抓挠运动后下颌靠在地板上，无力抬起头；２级休息时表现出像１级一样的无力；３级为濒死状态、脱水和瘫痪［１］。
小鼠症状分５级：１级为尾部活动无力；２级为后肢无力；３级为后肢瘫痪；４级为全身瘫痪；５级为濒死状态或死亡［２］。
１．５新斯的明实验对所有表现出肌无力的小鼠，可给予新斯的明进行观察。
新斯的明３７．５μｇ／ｋｇ和阿托品１５μｇ／ｋｇ腹腔注射，大约１２ｍｉｎ后无力的症状得到缓解，小鼠表现出接近正常的姿势，并且开始进食、饮水。
这种新斯的明诱导的无力症状的改善大约可持续２～１２ｈ，持续时间的长短主要取决于瘫痪的轻重。
１１６２被动免疫的实验性自身免疫性重症肌无力动物模型２．１实验动物实验中选用严重联合免疫缺陷小鼠为实验动物。
严重联合免疫缺陷鼠没有成熟的Ｂ细胞和Ｔ细胞，免疫功能严重缺陷。
２．２模型的诱导给严重联合免疫缺陷鼠接种重症肌无力患者的血淋巴细胞，可以在其血液中产生人类的抗乙酰胆碱受体抗体，从而造成小鼠运动终板的组织损伤。
取重症肌无力患者外周血５０ｍＬ，用淋巴细胞分层液分离提取淋巴细胞，将包含（２．０～２．５）×１０７淋巴细胞的磷酸盐缓冲液０．３ｍＬ腹腔注射于免疫严重联合免疫缺陷鼠。
２．３模型的评估免疫后的严重联合免疫缺陷鼠不能够产生类似于临床上重症肌无力的体征，其表现需要通过一种肌松药予以检测。
选用的药物为泮库溴铵（ｐａｖｕｌｏｎ），以０．０３ｍｇ／ｋｇ腹腔注射［３］。
小剂量给予泮库溴铵不能激活严重联合免疫缺陷鼠肌肉上的乙酰胆碱受体片段，对正常小鼠的肌力不会产生任何影响，这样就有助于揭示免疫后的严重联合免疫缺陷鼠所产生的亚临床重症肌无力的表现。
具体评估方法采用悬挂实验法，腹腔注射ｐａｖｕｌｏｎ后，令免疫后的严重联合免疫缺陷鼠上肢抓握一横梁，如单杠运动员抓握单杠一样，处于一种悬空状态，正常小鼠抓握的时间一般在１０ｍｉｎ左右［４］，而免疫后严重联合免疫缺陷鼠抓握的时间明显缩短，以３次抓握时间的平均值为最终结果，短于１０ｍｉｎ即为悬挂实验阳性。
经以上方法诱导出的实验性自身免疫性重症肌无力动物模型，有助于对其病因进行深入分析，并为药物治疗提供了实验学依据。
总之，实验性自身免疫性重症肌无力模型的建立为临床研究和治疗重症肌无力提供了更广阔的空间。
３参考文献ＬｅｎｎｏｎＶＡ，ＬａｍｂｅｒｔＥＨ，ＬｅｉｂｙＫＲ，ｅｔａｌ．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈｕｍａｎａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅｒｅｃｅｐｔｏｒａｌｐｈａ－ｓｕｂｕｎｉｔｉｎｄｕｃｅｓｃｈｒｏｎｉｃｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌａｕｔｏｉｍｍｕｎｅｍｙａｓｔｈｅｎｉａｇｒａｖｉｓ．ＪＩｍｍｕｎｏｌ１９９１T １４６（７）：２２４５－８ＪａｈｎｇＡＷ，ＭａｒｉｃｉｃＩ，ＰｅｄｅｒｓｅｎＢ，ｅｔａｌ．ＡｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｎａｔｕｒａｌｋｉｌｌｅｒＴｃｅｌｌｓｐｏｔｅｎｔｉａｔｅｓｏｒｐｒｅｖｅｎｔｓｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌａｕｔｏｉｍｍｕｎｅｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ．ＪＥｘｐＭｅｄ２００１T １９４（１２）：１７８９－９９ＫａｒａｃｈｕｎｓｋｉＰ，ＯｓｔｌｉｅＮ，ＢｅｌｌｏｎｅＭ，ｅｔａｌ．ＭｅｃｈａｎｉｓｍｓｂｙｗｈｉｃｈｔｈｅＩ－ＡＢＭ１２ｍｕｔａｔｉｏｎｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙｔｏｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｍｙａｓｔｈｅｎｉａｇｒａｖｉｓ：ａｓｔｕｄｙｉｎｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓａｎｄｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓｍｉｃｅ．ＳｃａｎｄＪＩｍｍｕｎｏｌ１９９５T ４２（２）：２１５－２５ＫａｒａｃｈｕｎｓｋｉＰＩ，ＯｓｔｌｉｅＮＳ，ＯｋｉｔａＤＫ，ｅｔａｌ．ＰｒｅｖｅｎｔｉｏｎｏｆｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｍｙａｓｔｈｅｎｉａｇｒａｖｉｓｂｙｎａｓａｌａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎｏｆｓｙｎｔｈｅｔｉｃａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅｒｅｃｅｐｔｏｒＴｅｐｉｔｏｐｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．ＪＣｌｉｎＩｎｖｅｓｔ１９９７T １００（１２）：３０２７－３５１２３４ＩＳＳＮ１６７１－５９２６ＣＮ２１－１４７０／Ｒｗｗｗ．ｚｇｌｃｋｆ．ｃｏｍｋｆ２３３８５０８３＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ杨春晓，等．实验性自身免疫性重症肌无力模型的制备当然这些方格显现出来的亮暗程度代表一定的灰度级。
如图１即表示了这种操作：图中阴影方格表示原有的灰度级图像，阴影方格与邻近阴影方格间的方格为使用插值法而新插入的方格。
其图形的数字表达为：ｍ＝（ｘ２－ｘ１）／４；ｔｌ＝ｘ１＋ｍ；ｔ２＝ｘ１＋２ｍ；ｔ３＝ｘ１＋３ｍ（注：ｘ１、ｘ２为代表相邻方格的光强度级，ｔｌ、ｔ２、ｔ３为ｘ１、ｘ２之间顺次插入的方格所代表的光强度级。
）１．３实现光强度级到灰度的转换上述工作都做好后，接下来就要实现灰度图的显现。
这就需要将３０个光强度级转换成对应的灰度级，并显现在屏幕上。
接下来就要使用ＶｉｓｕａｌＢａｓｉｃ６．０的画图功能来实现重建灰度图的显现与打印。
由于重点仅讨论重建的算法，因此软件的设计与实现在此不予讨论。
２结果使用这种插值算法是有效可行的，它可以很好的解决敏感度值有限而带来的局限性。
３讨论在使用视野球计的实际测量中，得到的测量值非常有限。
这些有限的测量值（即视野敏感度值），对应该点人眼所能看到的视野球计内排布的红色ＬＥＤ发光的强度。
然后将这些值转换成相应的灰度值［１，２］，并以相应的灰度图像显现出来。
具体操作过程：检测时采用盲点监测法来监视受检人的固视情况［３，４］。
根据不同的眼别选择不同的盲点监测灯组，每组４个ＬＥＤ，找到受检人固视好时看不到的ＬＥＤ，以此ＬＥＤ作为盲点监测灯，然后，ＬＥＤ按照程序从给定的初始刺激阈值开始以一定时间间隔发出刺激光。
若在初始阈值下病人有反应，则下一时间间隔ＬＥＤ亮度变弱，直到在某一亮度下患者没有反应，则受检人在该亮度前１次反应的ＬＥＤ亮度所对应的阈值就是受检眼在该点的视网膜阈值。