荧光原位杂交（FISH）1.样品处理与固定(约4h，可提前准备)（1）用纯水清洗样品数次，加1×PBS，涡旋悬浮样品，离心（2000r/min）5min 弃去上清液；（2）在样品中加入4%多聚甲醛（终浓度4%），置于4℃固定3小时左右；（3）离心（12000r/min）5min，弃去上清液；（4）加1×PBS摇匀清洗3次，离心（10000r/min）5min弃去上清液；（5）加0.5mL1×PBS和0.5mL乙醇，重悬样品，-20℃可保存6个月。
2.载玻片涂层处理（约2.5h，可提前准备）（1）将载玻片用盐酸乙醇溶液中（1份盐酸2份乙醇）浸洗10min，然后用自来水水充分清洗，再用纯水清洗2-3遍，100%乙醇中贮存备用；（2）拿出玻片晾干后，滴一滴poly-L-lysine（0.1mg/mL）溶液于载玻片上，覆盖样品孔，室温放置10-30min分钟；（3）吸去多余的溶液，用无菌水冲洗表面数次；（4）接种前至少室温干燥1小时或过夜晾干。
3.透化与脱水（约1h）现配proteinase k buffer：50mL1M Tris/HCl0.5mL0.5M EDTA1mL5M NaCl1mL10%SDS 2.5mLdd H2O to50mL pro.k(20mg/mL)25μL（1）取适量固定后样品于载玻片上（可提前超声破碎），放入46℃孵育箱中烘干10分钟；（2）将样品浸入蛋白酶k缓冲液中，37℃，20min，然后浸入灭菌水中清洗3次，每次1min。
（3）再依次浸入50%、80%、100%乙醇中脱水，每次3min，最后在空气中晾干。
4.杂交（约2h）（1）加9μL杂交缓冲液到载玻片的样品上，尽量让样品全被覆盖；（2）（此步之后，保证样品充分避光）在杂交缓冲液上加1μL探针（终浓度5ng/μL）；（3）将载玻片水平放在有2×SSC的湿盒中，盖盖，然后一起放入46℃孵育箱中，杂交1.5小时；（4）将冲洗缓冲液预热到48℃，备用。
5.冲洗（约1h）（1）杂交后，迅速（防止载玻片变冷）小心用预热的冲洗液冲洗载玻片1~2次；（2）然后快速将载玻片放入48℃冲洗液中，在48℃放置20min；（3）用灭菌水润洗载玻片3次，最后在空气中晾干。
6.镜检与拍照（约2h）（1）晾干后，滴一滴抗荧光衰弱剂，小心盖上盖玻片，使样品被抗荧光衰弱剂覆盖，排除气泡，吸去多余液体，然后用指甲油封边。
（2）及时进行镜检，紫外易使荧光猝灭，应在同视野下最后观看。
（3）镜检后，样品可于-20℃暗处保存。
试剂配制与说明（1）10×PBS：称取12.9g（Na2HPO4·12H2O）、2.2g（NaH2PO4·2H2O）、37.7g （NaCl）溶于500mL纯水中，高温高压灭菌保存。
稀释至1×使用，pH7.2。
（2）4%多聚甲醛：将44.5mL纯水加热到60℃，称取2g多聚甲醛加入其中，加2滴NaOH使其溶解，冷却至室温，加5mL10×PBS，以上均在通风橱中进行，用HCl调整pH到7.2，用0.22μm滤膜过滤，4℃避光保存。
（3）盐酸乙醇溶液：1份浓盐酸和2份乙醇混合，清洗液，主要用于去除带颜色的有机染料。
（4）Poly-L-lysine溶液：Cat.NO.:E607015，规格为1mL，5mg/mL，可储存于-20℃保存12个月，取80μL加无菌水稀释50倍（0.1mg/L），分装储存于5mL离心管，-20℃保存。
（5）梯度乙醇：配制50%、80%、100%梯度乙醇，现配现用。
（6）探针：探针暗处用铝箔纸包裹放于冰上，12000r/min离心5min，加适量DEPC处理水，于暗处振荡5~10min溶解，吸取10μL，加DEPC水稀释至100μL，分装于无菌EP管，每份10μL，包裹锡箔纸，-20℃保存。
（7）5M NaCl：称取29gNaCl分多次溶于约90mL水中，等待完全溶解，高温高压灭菌。
（8）1M Tris/HCl：称取12.11g Tris溶于80mL水中，溶解后用浓盐酸调pH 至7.2，定容到100mL，高温高压灭菌。
（9）Formamide：通风橱内封装2mL甲酰胺，4℃保存。
（10）10%SDS：称取10g SDS于水中，静置放置，约20min后溶解，定容至100mL。
（11）0.5M EDTA：称取18.6g EDTA二钠溶于80mL水中，用NaOH颗粒调pH至7.2，定容到100mL，高温高压灭菌。
（12）20×SSC：称取17.52g NaCl、8.82g二水柠檬酸钠溶解于80mL纯水中，用NaOH调节pH至7.0，定容至100mL，过滤除菌。
（13）杂交缓冲液：Stock reagent Volume final concentration5M NaCl360μL900mM1M Tris/HCl40μL20mM Formamide%depending on probedistilled H2O add to2mL10%SDS2μL0.01%(add SDS last to avoid precipitation)Considered Formamide：AOB,20%;PAO/GAO,35%.（14）冲洗缓冲液：Stock reagent Volume final concentration5M NaCl concentration dependingon buffer(see table A inappendix)%formamide in hybridization1M Tris/HCl1mL20mM0.5M EDTA(only if≥20%formamide inhybridization!)(500μL)5mMdistilled H2O add to50mL10%SDS50μL0.01% (add SDS last to avoid precipitation)（15）Table A:%formamide in hybridization buffer [NaCl]in M endconcentrationμL5M NaCl in50mLwashing buffer00.900900050.6366300100.4504500150.3183180200.2252150250.1591490300.1121020350.080700400.056460450.040300500.028180550.020100600.0144065--70--（16）探针：探针荧光素5`-3`指向菌群Nso1225FITC绿CGCCA TTGTA TTACG TGTGA AOB（20%）Nso190FITC绿CGATC CCCTG CTTTT CTCC AOB（20%）NIT3HEX红CCTGT GCTCC ATGCT CCG NOB（55%）CNIT3CCTGT GCTCC AGGCT CCG竞争性探针EUB338I AMCA蓝GCTGC CTCCC GTAGG AGT most bact.（1-70%）EUB338II AMCA蓝GCAGC CACCC GTAGG TGT 补充I（1-70%）EUB338III AMCA蓝GCTGC CACCC GTAGG TGT 补充I（1-70%）PAO462Cy3红CCGTC ATCTA CWCAG GGTAT TAAC PAO（35%）PAO651Cy3红CCCTC TGCCA AACTC CAG PAO（35%）PAO846Cy3红GTTAG CTACG GCACT AAAAG G PAO（35%）GAO Q431FITC绿TCCCC GCCTA AAGGG CTT GAO（35%）GAO Q989FITC绿TTCCC CGGAT GTCAA GGC GAO（35%）EUB、PAO和GAO分别混合成EUBMIX、PAOMIX和GAOMIX后使用。
（17）荧光素：荧光素名称激发波长(nm)发射波长(nm)颜色氨甲香豆素乙酸（AMCA）351450蓝异硫氰酸盐荧光素（FITC）492528黄绿羧基荧光素（FAM）494518绿六氯荧光素（HEX）535553橙红德克萨斯红（Texas Red）578600红Cy3550570橙红Cy5651674暗红（18）激发光谱：激发光激发区域(nm)可见光起始光谱紫外光（UV）300-400425紫光（V）395-415455蓝光（B）420-485515绿光（G）460-550590备注：（1）加探针后所有操作均应该在暗室环境下进行。
（2）杂交温度的选择。
在37℃-45℃均可进行，选择42℃是因为37℃时杂交灵敏度高，但太多非特异性杂交。
45℃杂交特异性高，但灵敏度降低。
选择中间42℃比较适宜。
（3）在多数情况下，如果FISH操作没有得到正常的结果，我们可以将探针洗去，然后使用同样的探针进行再次的杂交。
（4）在FISH中最重要的因素是温度、光照、湿度和各种试剂的PH值。
温度和湿度直接影响着探针和目标DNA的杂交效率；光照影响了荧光染料的强度；各种试剂pH是否符合要求直接关系到FISH的稳定性。
所以同样的样本及探针在冬天更应该注意温度的控制，或者适当延长浸泡洗涤及消化时间。
Refference/jishu/0412351.htmlhttp://www.arb-silva.de,FISH&Probes section。