ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
胰岛素的蛋白质工程研究
胰岛素在临床应用时存在的问题 1、在正常生理情况下胰岛素在体内是不断 地分泌的，但不能连续不断地注射胰岛素

2、皮下注射胰岛素时，吸收得也很慢，注 射后1.5-2小时，体内胰岛素水平还未能达 到高峰，这就会导致高血糖；3-5小时之后 胰岛素水平仍在继续上升，这又会导致低 血糖

蛋白质从头设计 蛋白质分子设计策略
蛋白质从头合成的范例 凋亡诱导肽：CNGRC-GGn-（KLAKLAK）2
KLAKLAK：可形成典型的两亲-螺 旋结构，进入细胞后，可破坏线粒 体膜引起细胞凋亡
NGR：与新生血管的内皮细胞特异 结合，起到靶向弹头的作用
三个基本条件 蛋白质分子设计的分类
蛋白质分子设计
三个基本条件 蛋白质分子设计的分类
蛋白质分子设计
蛋白质从头设计

蛋白质从头设计 蛋白质分子设计策略
概念：从蛋白质分子一级结构出发，设计 制造自然界中不存在的全新蛋白，使之具 有特定的空间结构和预期的生物功能。 1、需要扎实的理论基础 2、在分子设计与试验验证之间交互进行
三个基本条件 蛋白质分子设计的分类
04 蛋白质工程制药
S1 蛋白质工程制药概述 S2 蛋白质工程的基本技术 S3 蛋白质工程制药实例
S1 蛋白质工程制药概述

从基因工程药物到蛋白质工程药物 蛋白质工程的诞生、概念 蛋白质工程的基本过程 蛋白质分子设计
基因工程药物蛋白质工程药物

1982年第一个基因工程药物：重组人胰岛素

蛋白质工程的概念
内涵： 1、从DNA水平改变基因，改造蛋白质 2、一个或多个氨基酸残基 从不同尺度改造 结构域 全新蛋白质 3、有目的地改造，获得期望功能 ——强调分子设计 4、结合DNA重组技术

蛋白质工程的基本过程
蛋白质工程的基本过程
实验 设计 1、分离纯化所需改造的目的蛋白 2、对蛋白进行氨基酸序列测定、X射线晶体衍射 分析、核磁共振分析等——结构和功能信息 3、根据结构和功能信息、生物信息学信息，运 用蛋白质分子预测技术提出蛋白质设计方案 4、分离克隆该蛋白编码基因，并进行突变改造 5、插入适当的载体表达 6、分离纯化表达产物，检测其生物学功能
蛋白质从头设计

蛋白质从头设计 蛋白质分子设计策略
蛋白质从头合成的范例 凋亡诱导肽：CNGRC-GGn-（KLAKLAK）2
利用NGR为弹头，将KLALAK肽特异地导向肿瘤部位 的新血管内皮细胞，通过抑制新血管的生成，从而 抑制肿瘤的形成，且对其他细胞没有明显的毒性。
300mol/L 3mol/L

B链Ser9 Asp（-），Thr27 Glu（-） 由于相同电荷互斥，减少多聚体形成，吸收速 度比野生型胰岛素要快许多——“速效胰岛素”
速效胰岛素

1996年，第一个速效胰岛素Lispro在欧美 批准上市 B链 Pro28 Lys29（＋）
A、自身聚集的倾向大大降低，静脉注射 15min起效，1h达到顶峰[45min]； B、血浆清除迅速（2-4h），减少了引起低 血糖的危险。
胰岛素是治疗糖尿病的特效药 1、糖尿病

中国4000万，全球1.5亿患者 急性并发症：
酮症酸中毒（I，昏迷、死亡） 非酮症高渗性昏迷（II） 低血糖反应（心慌、手抖、饥饿、出冷汗）
胰岛素的蛋白质工程研究
胰岛素是治疗糖尿病的特效药 1、糖尿病

中国4000万，全球1.5亿患者 慢性并发症（可遍及全身各重要器官）：
优点：体外定向进化，快速，高效 （蛋白质、酶、抗体等）

DNA改组技术
基因家族改组


DNA改组的不足：从单一基因出发，得到 的随机点突变率很低，且有益突变的积 累相对缓慢 在自然界中，不同物种同源基因本身就 是具有非常丰富的变异，如果加以利用， 就可以大大地加速基因在体外的进化速 度——基因家族改组（DNA family
蛋白质分子设计
蛋白质从头设计

蛋白质从头设计 蛋白质分子设计策略
蛋白质从头合成的范例 凋亡诱导肽：CNGRC-GGn-（KLAKLAK）2 实验结果
1、特异地被激活的新生血管内皮细胞内吞，引起凋亡
2、在小鼠肿瘤模型中，可抑制肿瘤的生长，明显延长 治疗组小鼠的存活时间 3、对健康小鼠超剂量使用时，没有毒副作用的产生
三个基本条件 蛋白质分子设计的分类
蛋白质分子设计
蛋白质从头设计

蛋白质从头设计 蛋白质分子设计策略
蛋白质从头合成的范例 凋亡诱导肽：CNGRC-GGn-（KLAKLAK）2 考虑的其他因素
1、Gly-Gly接头：防止两功能部位的立体结构相互影响。 2、L-型氨基酸（D-型）：防止蛋白酶的降解
三个基本条件 蛋白质分子设计：从功能入手进行筛选所需要的蛋白 3）进行蛋白质基本结构、序列信息的分析
三个基本条件 蛋白质分子设计的分类
蛋白质分子设计
蛋白质分子设计的策略 3、两种策略的结合
蛋白质从头设计 蛋白质分子设计策略
非理性的体外进化：弥补合理性化设计应用中的局 限性，并且迅速得到大量有功能的目标分子，通过 分析积累所需的蛋白质结构与功能相关信息 合理化设计：对非理性筛选出的候选分子进行合理 化的分子修正，使之进一步符合实际需求
实验
蛋白质分子设计

三个基本条件 蛋白质分子设计的分类 蛋白质从头设计 蛋白质分子设计策略
三个基本条件 蛋白质分子设计的分类
蛋白质分子设计
蛋白质从头设计 蛋白质分子设计策略
蛋白质分子设计的三个基本条件：
1、蛋白质分子的基本知识：理化性质、结构与 功能、构象规律 2、对具体改造的蛋白质分子必须有一个系统、 全面和深入的了解 3、分子设计的基本工具：高性能的计算机硬件、 功能齐全的计算机软件 ——只有在此基础上，才能应用蛋白质分子预测 技术，提出合理的设计方案
可遗传的变化只发生在单一分子内部，属于无性进 化（asexual evolution）
易错PCR

优点：简便易行 不足：突变规模有限，有益突变少，后续筛选工作费力、耗时，只适用 于较小的基因片段（< 800bp）
DNA改组技术

DNA改组（DNA shuffling），又叫有性PCR （sexual-PCR）等，将单一基因随机片段 化，这些片段自配对PCR扩增，由于易错 PCR而引入大量随机突变，并在多次循环 中重组，使基因在体外迅速进化，从中 筛选到有益重组。

蛋白质工程技术对胰岛素的改造
1、速效胰岛素（可快速吸收的单体胰岛素） 2、长效胰岛素 3、高效胰岛素（与受体亲和力增加的胰岛素突变体）
速效胰岛素

胰岛素吸收慢的原因：二聚体、六聚体
速效胰岛素

3D分析发现：多聚体的形成与B8、B9、B12、 B13、B16、B23-B28的氨基酸残基有关
用蛋白质工程方法在多聚体接触面上某些氨 基酸残基换上带负电的氨基酸残基
蛋白质从头设计 蛋白质分子设计策略
1、顺式思维理性化设计 ——合理化设计 基于现有知识信息：蛋白质的结构与功能； 因此，受到已有认识水平的制约。
蛋白质从头设计
三个基本条件 蛋白质分子设计的分类
蛋白质分子设计
蛋白质分子设计的策略
蛋白质从头设计 蛋白质分子设计策略
2、基于各种功能筛选平台的非理性逆向改 造策略——非理性的体外进化
心血管疾病、慢性肾病 视网膜病变、神经病变
胰岛素的蛋白质工程研究
胰岛素是治疗糖尿病的特效药 2、胰岛素

胰岛素的蛋白质工程研究
胰岛素是治疗糖尿病的特效药 2、胰岛素

胰岛素从猪、牛等动物的胰腺中提取，100Kg胰 腺只能提取4-5g的胰岛素，其产量之低和价格 之高可想而知。
胰岛素的蛋白质工程研究
胰岛素是治疗糖尿病的特效药 2、胰岛素 1982年，重组人胰岛素上市 ——第一个基因工程药物！

第一个完成序列测定的蛋白质（1958年） 第一个人工合成的蛋白质（1965年）
Sanger
胰岛素的蛋白质工程研究
胰岛素是治疗糖尿病的特效药 2、胰岛素

每100L发酵液就能产 生5g胰岛素，使其价 格降低了30%-50%! 提取4-5g胰岛素需要 100Kg胰腺
S2 蛋白质工程的基本技术

定点突变技术

随机突变技术
1、寡核苷酸引物介导
的定点突变 2、PCR介导的定点突变 3、盒式突变
4、易错PCR
5、DNA改组技术
易错PCR


易错PCR（error-prone PCR）：利用缺乏修复功 能的Taq酶，并设臵容易引起出错的PCR反应条件， 在扩增目的基因的同时引入碱基错配，导致目的 基因随机突变——完全随机化 连续易错PCR（sequential error- prone PCR）： 经以上一次PCR突变的基因很难获得满意的结果， 于是将前一轮PCR扩增得到的有用突变基因作为下 一轮PCR的模板，每次获得的突变累积起来，产生 重要的有益突变。
胰岛素的蛋白质工程研究

胰岛素在临床应用时 存在的问题
3、糖尿病病人一般需 要每日四次注射给药
胰岛素的蛋白质工程研究
蛋白质工程技术对胰岛素的改造 1970S初，英国的Hodgkin等、我国的梁栋 材等，分别用X-射线晶体衍射法进行了 高分辨率的三维结构分析，胰岛素的蛋 白质工程研究奠定了基础

胰岛素的蛋白质工程研究
1、体内半衰期短
2、药理活性不够强
已上市的蛋白质工程药物
3、毒副作用大 4、生产工艺复杂
1、体内半衰期短
2、药理活性不够强
已上市的蛋白质工程药物
3、毒副作用大 4、生产工艺复杂
1、体内半衰期短