细胞环境，成份和化学物质的荧光染料
染色/区分活和死细胞 细胞成份染料 （线粒体，溶酶体，内质网和Golgi体） 核酸染料（如：DAPI, Hoechst, BO-PRO, POPO） 离子敏感性染料（Ca2+, Mn2+, Zn2+, Na+, K+, Cl-） 膜电位敏感染料（罗丹明123）
B: Immunostaining against endosomal marker EEA1, cy5-conjugated secondary ab
S. Arnold 10/2002
转染技术的选择对转染结果影响也很大，许多转染方法需要优化DNA 与转染试
剂比例，细胞数量，培养及检测时间等。一些传统的转染技术，如DEAE 右旋糖 苷法，磷酸钙法，电穿孔法，脂质体法各有利弊，其主要原理及应用特点见下表：
Alexa 568 DsRed Rhodamine Texas Red DiD
DiI
Organelle markers
PI
Hoechst 33258
PI
DAPI
MitoTracker
Anti-Calnexin
ER
Phalloidin
GM-130
Actin
EEA1
LysoTracker Tubulin
荧光染料
Atto and Tracy (Sigma Aldrich) Alexa Fluor (Invitrogen) BODIPY (Invitrogen) Cy-dyes FluoProbes (Interchim) DyLight Fluor (Thermo Scientific, Pierce) DY and MegaStokes Dyes (Dyomics) Sulfo Cy dyes (CYANDYE, LLC)
荧光蛋白
The FP beach
R.Tsien 2009 Nobel lecture
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荧光蛋白主要应用
1. 活细胞中的某种蛋白进行准确定位及动态观察 2. 可实时原位跟踪特定蛋白在细胞生长、分裂、分化过程中或外界 刺激因子的作用下的时空表达, 如某种转录因子的核转位、蛋白激酶C 的膜转位等。 3. GFP基因与分泌蛋白基因连接后转染细胞, 可动态观察该分泌蛋白 分泌到细胞外的过程
[Ca2+]= Kd* Q*(R-Rmin)/(Rmax-R) - R represents the fluorescence intensity ratio F lambda 1 /F lambda 2 in which lambda 1 (~340 nm) and lambda 2 (~380 nm) - Q is the ratio of F min to F max at lambda 2 (~380 nm) - Kd is the Ca 2+ dissociation constant of the indicator D.J. Linden, Purkinje neuron
30
细胞骨架F-actin（F-肌动蛋白）染色：
用FITC或Rhodamine标记的Phalloidin（鬼笔环肽）
膜电位探针
罗丹明123染细胞线粒体（双氢罗丹明123：10uM/ml）： 10ug/ml，室温，15分钟。Ex/Em: 511/534（488/BP505-530） 为膜电荷性染料，对活细胞，能特异与细胞中的线粒体膜结合，产生荧光。 反应线粒体功能。 死细胞无显色。
Ratiometric Ca Indicators Fura-2 Fura-6F Fura Red Indo-1 Indo-5F Mag-indo-1
2+
Mode Ex 340/380 Ex 340/380 Ex 420/480 Em 405/485 Em 405/485 Em 405/485
Kd (nM) 145 5300 140 230 470 35,000
荧光蛋白
量子点 （纳米晶体） 更多
很亮，光稳定，可调变光谱， 特异性细胞内标记比染料还 宽激发光谱，窄发射光谱 难，庞大（10-15nm）
荧光探针的使用
• 定位（蛋白质，DNA，脂类）
• 互相作用，空间结构改变 • 细胞环境报道（pH, Ca++, 酶活性） • 基因表达报道
•选择荧光探针
• 光谱分离性 • 毒性 • 光稳定性 • 光亮度
共聚焦显微镜生物学相关荧光样品制备
共聚焦显微镜生物学相关荧光样品制备 Dr Lijun Wu
2015/10/27
Leica / Shanghai
23/6/2014
3
• 形态学分析
• 免疫组织化学 • 记录基因活动 • 影响基因活动 • 原位杂交 • 多色FISH • 细胞追踪
显微镜：明场、相差、微分干涉、荧光图象
Early Endosome
Fluorescence Microscopy Fluorochromes
Fluorochrome
DAPI (DNA) Hoechst 33258 (Bisbenzimid) Lucifer Yellow GFP green Cyanine Cy2 Alexa 488 FITC Fluoresceinisothiocyanat TRITC, Rhodamin Alexa 546 DiI Indocarbocyanine DiO Carbocyanine Cyanine Cy3 Texas red
荧光团类型
自发荧光
优点
本身，天然
缺点
无法控制，通常是令人讨厌 的
荧光染料
明亮，光谱范围大，相对光 稳定，大的行程移动，尺寸 小，可以做成对环境敏感
通过融合目标蛋白可以在活 细胞内表达；可以作为结构 破坏的靶；对一些环境参数 敏感
特异性标记细胞内蛋白质比 较困难；抗体介导的标记； 细胞通常要被固定
波长选择有限，低光稳定性， 不是很亮，光谱交叉，相对 庞大（5um）
A
Color outside the lines
Whatever comes next…
CGFP Alexa 350 CFP Alexa 488 GFP Fluorescein Oregon green DiO new XFP variants? Alexa 543 YFP DiA
DAPI Hoechst
PKC
IP3 DAG
ATP cAMP+PPi
IP3 DAG
PKC
Ca2+
ATP
cAMP+PPi
PKA
Ca2+
Calmodulin
PKA
Ca2+
Calmodulin
IP 3-R
IP3
Ca2+
ER
CaM KII
IP3
IP 3-R
TAG
Postsynaptic
TAG
Ca2+
ER
CaM KII
MAPK p90rsk-1 (Angenstein)
2）溴化乙啶（EB）和碘化丙啶（PI）： 与DNA结合，于细胞核产生荧光（红色）。 EB（10ug/ml）：510/595，PI（10ug/ml）：536/623
3）DAPI和Hoechst33258，Hoechst33342: 与细胞核DNA结合，产生荧光。 DAPI: 350/470 Hoechst33258: 360/505 Hoechst33342: 340/450
荧光
荧光检测的优缺点
一、优点 1、敏感 2、专一 3、快速 4、容易 5、简单 6、应用范围广 7、可靠 二、缺点 1、试剂贵 2、仪器贵 3、染色后样品不易保存，荧光淬灭
荧光样品染色
• 免疫荧光细胞化学法 • 荧光探针 • 荧光蛋白基因转染 • 量子点法 用于体内标记的荧光探针
生物学中应用的荧光探针
1.荧光染料 Alexa Fluor 系列荧光染料激发和发射光谱窄可用于多重荧光 标记而更少光谱重叠 ATTO 系列荧光染料具有较强的光稳定性和热稳定性，已被 应用于STED (Stimulated Emission Depletion 受激发射损耗) 超 高分辨率显微成像技术 DyLight、CF 等更多新型荧光染料系列都将因其较高的激发 效率、良好的光稳定性、宽泛的PH 稳定性等优越的特性而 被广泛的应用于组织及细胞免疫荧光标记。
Excitation
359 365 428 471 489 495 490 540 556 540-560 550 575 595
Emission Filterset No.
461 480 540 503 505 505 525 580 573 556-575 580 605 620 1, 2, 25 1, 2 5 9, 10, 16, 17 9, 24 9, 24 9, 10, 16, 17,23-25 14, 15, 23-25 14, 15, 23-25 14, 15, 0, 26 9, 10, 14, 15, 0 15, 20, 24 0
Cellular Localization
Afferent Input S2
NMDA AMPA
Afferent Input S1
NMDA
mGluR
1, 5
mGluR
2,3,4,6,7
mGluR
AMPA
1, 5
mGluR
2,3,4,6,7
G
PLC PIP 2
Gi
AC
G
PLC PIP 2
Gi
AC
Ca2+
4. GFP基因与定位于某一细胞器特殊蛋白基因相连,就能显示活细胞 中细胞核、内质网、高尔基体、线粒体等细胞器的结构
5. 蛋白之间相互作用（FRET）