探针酶
既保持高度反应性，又能在DNA中任意选定的区域内进 行切割。 EDTA Fe(II)X EDTA Fe(II) EB 探针酶 X为探针 EB与DNA能任意结合，所以在
DNA上的切点是随机的。
探针酶与限制性内切酶比： a. 切点不够准确。 b. 有较大的灵活性，可在任意位置上切割。
对于酶和生物催化剂概念的认识
Ribozyme 抗体酶 探针酶 人工酶 模拟酶 克隆酶和突变酶

Antibodies having catalytic activities can be generated



The concept of inducing antibodies with catalytic potentials rooted in Pauling’s transition state theory (1940s); William Jencks predicted the existence of such antibodies in 1969; Richard Lerner and Peter Schultz generated such catalytic antibodies in 1986; Catalytic antibodies have been generated catalyzing various chemical transformations, ranging from simple hydrolysis to reactions that lack physiological counterparts or even are normally disfavored.
•1 kat = 1 mol sec-1
（二）酶活力单位、比活力
1.酶活力单位
(1)国际单位U（international unit,IU或U）
特定条件下，1min内，能转化1 μmol底物所 需要的酶量。 1 IU（U）= 1 μmol/min
(2)Katal单位
1 Kat = 1 mol/s
1 Kat = 6 107 U
pH gradient
_ _ _ _ + + 7.0 6.0ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ5.0
_ _ _ _ + --
_ _ _ + + +
_ _ _ + + +
1
pH 10
Isoelectric focusing
pH 4
2 SDSPAGE
Two-dimensional gel electrophoresis
根据酶分子专一性结合的分离方法
分子酶学 (Enzymology)

About Myself
Wang Xiao-Yun (王晓云）
Professor,Ph.D. in Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Life Science Tel: 2656-8430
2.比活力
每毫克酶蛋白所具有的酶活力单位数。 （U/mg蛋白） 比活力越高，表示酶制剂越纯。
3.酶促反应的初速度

四、酶活力的测定
（一）酶活力（enzyme activity)
酶催化某一反应的能力——V V——单位时间内单位体积中
底物（substrate)的减少量或
产物（product)的增加量
Enzyme assays
•An enzyme assay measures the conversion of substrate to product, under conditions of cofactors, pH and temperature at which the enzyme is optimally active. •High substrate concentrations are used so that the initial reaction rate is proportional to the enzyme concentration. •Enzyme activity is commonly expressed by the initial rate (Vo). The units of Vo are mol min-1 •1 U=1 mol min-1

改变pH值或温度
调节pH至pI， 加热去除杂蛋白
改变介电常数
常用有机溶剂乙醇、丙酮、甲醇
根据酶分子大小、形状不同的分离方法
离心分离 凝胶过滤 透析 超滤

Ultracentrifugation
Gel filtration chromatography
dialysis
Ultrafiltration
自然酶、化学修饰酶、固定酶、人工酶、
模拟酶的研究、利用
生物酶工程（高级酶工程） 克隆酶 、 突变酶 、抗体酶
三、酶的分离纯化

建立一个可靠快速的测活方法 酶原料的选择 酶的提取 酶的提纯 酶纯度的鉴定
建立一个可靠和快速的测活方法

可靠性表现在专一、灵敏、精确、简便 测活方法是否经济 测活方法越简单，纯化所需等待时间越短，失 活越少
都是现代生物学领域的人不能不涉足的一 门科学。
Enzymology
第一节 酶的分离纯化与活性测定
第二节
第三节 第四节
酶的结构与功能
酶促反应动力学 变（别）构酶、同工酶
第一节 酶的分离纯化与活性测定
一、概述
Ferment－－（酵素）
Enzyme－－在酵母中（希腊文）
1926年 美国“独臂学者”Sumner用全能的 右手，花了9年时间，从刀豆中提出了脲酶结晶， 并证明具有蛋白质。（不负载任何活性基团的脲 酶蛋白质结晶 。 30年代 胃蛋白酶 pepsin 胰蛋白酶 trypsin 胰凝乳蛋白酶 chymotrypsin 结晶并进行了动力学探讨，确立了酶的化学本质 推动了蛋白质研究。
Ultrafitration has become a widely used technique in preparative biochemistry. Ultrafiltration membranes are available with different cutoff limits for separation of molecules from 1 kD to 300 kD. The method is excellent for the separation of salts and other small molecules from a protein fraction with a higher molecular weight and at the same time can effect a concentration of the proteins. The process is gentle, fast, and comparatively inexpensive.

Office: 6#430
参考书： 1. 袁勤生主编， 现代酶学，华东理工大学出 版社，2001 2. 姜涌明主编，分子酶学导论，中国农业大 学出版社，2000 3. 王镜岩等主编，生物化学（第三版），高 等教育出版社，2002
酶可以说是一切生命活动的序幕——化
学变化，酶决定机体的化学变化。
酶学无论从理论上讲或是从应用上讲，
人工酶 模拟酶

人工酶 人工合成的具有催化活性的蛋白 质或多肽。 模拟酶 利用有机化学合成的一些比酶结 构简单得多具有催化功能的非蛋白质分 子。

克隆酶和突变酶

克隆酶 用基因工程技术生产的酶

突变酶 用基因定位突变技术修饰天然酶 基因，然后用基因工程技术生产该突变 基因的酶，被称为突变酶。
酶蛋白 蛋白酶 蛋白质酶
可加入蛋白酶抑制剂如PMSF（苯甲基磺酰氯）、 EDTA、还原剂DTT（二硫苏糖醇）等，保护目的酶。
酶提取方法的选择
抽提液由以下几部分组成 离子强度调节剂 KCl NaCl 蔗糖 pH缓冲剂 各种 Buffer 温度效应剂 甘油 二甲基亚枫(DMSO) 蛋白酶抑制剂 PMSF DIFP 抗氧化剂 DTT 巯基乙醇 重金属络合剂 EDTA 柠檬酸 增溶剂 TritonX-100
抗体酶发展前景 它是研究酶作用机理的有利工具，在抗体酶的研 究过程中，可以直接观察到过渡态理论设计抗体酶 起到的作用，为酶的过渡态理论的正确性提供了有 利的实验证据。 抗体酶可以直接作为药物，进入组织，达到治 疗效果。它们可能象限制性内切酶切割DNA分子一 样，任意切割多肽链，用于治疗艾滋病和各种癌症。
Native PAGE
SDS-PAGE
Isoelectric Focusing (IEF)
IEF can be described as electrophoresis in a pH gradient set up between a cathode and an anode with the cathode at higher pH than the anode. Proteins, being amphoteric species, are positively charged at pH values below their pI and negatively charged above their pI. It means that whenever a protein is in the gradient, it will migrate towards its pI.
酶纯化方法的选择

调节酶溶解度的方法 根据酶分子大小、形状不同的分离方法 根据酶分子电荷性质的分离方法 根据酶分子专一性结合的分离方法 酶纯化方法选择的一般原则