2009年4月第47卷第11期·论著·急性髓系白血病（Acute myeloid leukemia，AM L）是一种以造血干/祖细胞获得性突变为特征的恶性克隆性疾病，大约55%的成人病例在诊断时出现非随机的克隆性染色体异常，儿童病例的检出率更高，但正常核型检出率在AM L中达到40%～47%[1]。
染色体畸变能在转录水平干扰造血调控、影响髓系细胞分化，因此快速、简便地获得患者染色体遗传缺陷的信息是临床亟待解决的问题。
本研究采用多重RT-PCR方法一次可同时检测29种基因重排，提高了隐匿性染色体易位的检出率，用于初诊时的筛选，对临床分型、预后判断及指导个体化治疗具有重要价值。
1材料与方法１．１对象选取2006年1月～2008年11月山西医科大学第二医院及山西省儿童医院血液科门诊或住院AM L初治患者60例，男30例，女30例，年龄1～70岁，中位年龄35岁。
所有病例均经临床、形态学、免疫学和组化染色确诊，分别为M1、M2、M3、M4各12例，M5、M6各6例。
所有病例均进行了染色体核型分析。
１．２方法1.2.1试剂和仪器TRIzol试剂盒购自美国Gibco/BRL公司；AM V逆转录酶、RNAsin、TaqDNA聚合酶购自美国Promega公司。
PCR扩增仪为美国Perkin-Elmer公司产品。
1.2.2细胞总RNA的提取和逆转录反应全部病例于初诊化疗开始前采取骨髓标本2～3mL，用淋巴细胞分离液提取单个核细胞，按Trizol一步法提取细胞总RNA，分光光度计测定A260值、A280值，以AM V逆转录酶系合成cDNA。
引物序列参照文献[1]方法设计。
逆转录广泛表达的转录因子（E2A）mRNA为内对照。
1.2.3多重巢式RT-PCR两轮均平行设置8组含有混合引物的多重PCR，同时检测29种染色体易位和畸变所形成的86种剪接形式。
每组检测的融合基因包括：第Ⅰ组inv（16）的CBF/M YH11；t（X；11）的M LL/AFX；t（6；11）的M LL/AF6；t（11；19）正常核型急性髓系白血病患者融合基因的检测赵瑾1*周永安1△苏丽萍1武坚锐2王恺1解菊芬1马莉1石磊3（1.山西医科大学第二医院血液科；2.山西省儿童医院检验科；3.山西医科大学第二医院风湿科，太原030001）[摘要]目的探讨急性髓系白血病（AM L）患者染色体畸变所形成的易位相关融合基因的临床和实验的关系。
方法采用多重巢式RT-PCR方法和染色体核型分析技术对60例AM L患者的融合基因进行分析。
结果18例（30%）正常核型的AM L 患者分别检测出有PM L/RARα、AM L1/ETO、TLS/ERG、CBFβ/M YH11和M LL/AF9等5种融合基因的存在。
结论多重巢式RT-PCR技术可用于白血病患者初诊时染色体畸变的筛选，可在核型正常的AM L患者中检出隐匿的染色体易位，对AM L 的诊断分型具有重要帮助，进一步指导临床个体化治疗。
[关键词]急性髓系白血病；融合基因；多重RT-PCR；正常核型[中图分类号]R733.7[文献标识码]A[文章编号]1673-9701（2009）11-11-03Det ect ion of Fusion Genes in Acut e Myeloid Leukemia Pat ient s wit h Nor mal Kar yot ypesZHAO Jin1ZHOU Yongan1SU Liping1WU Jianrui2WANG Kai1XIE Jufen1MA Li1SHI Lei31.Department of Haematology，the Second Teaching Hospital of Shanxi M edical University；2.Children's Hospital of Shanxi；3.Department of Rheumatism，the Second Teaching Hospital of Shanxi M edical University，Taiyuan030001[Abst r act]Object ive To investigate the fusion genes derived from chromosome structural aberrations in patients with acute myelocytic leukemia determined by multiplex RT-PCR and explore its potential clinical significance in diagnosis，treatment and prognosis evaluation. Met hods Bone marrow samples from60patients were analyzed with a novel multiplex nested RT-PCR and examination for chromosome karyotype.Result s5types of fusion genes such as PM L/RARα，AM L1/ETO，CBFβ/M YH11，TLS/ERG，M LL/AF9were detected in18（30%）patients with normal karyotypes by multiplex RT-PCR.Conclusion M ultiplex RT-PCR technique can quickly screen chromosome structural aberrations in patients with newly diagnosed leukemia.It is useful in detection of fusion genes in acute myeloid leukemia（AM L）with normal karyotypes and it would refine the karyotype analysis，help us to improve classification of the leukemia types of M ICM and to direct individulized chemotherapy.[Key Words]Acute myeloid leukemia；Fusion gene；M ultiplex RT-PCR；Normal karyotype*山西医科大学硕士研究生在读△通讯作者CHINA MODERN DOCTOR中国现代医生112009年4月第47卷第11期（下转第１９页）的M LL/ELL 。
第Ⅱ组t （1；11）的M LL/AF1p ；t （11；17）的M LL/AF17；t （10；11）的M LL/AF10；dupM LL 的M LL/M LL 。
第Ⅲ组t （1；19）的E2A/PBX1；t （17；19）的E2A/HLF ；t （12；21）的TEL/AM L1；SIL/TAL1D 。
第Ⅳ组t （8；21）的AM L1/ETO ；t （3；21）的AM L1/M DS1；t （16；21）的TLS/ERG ；HOX11。
第Ⅴ组t （4；11）的M LL/AF4；t （11；19）的M LL/ENL ；t （9；11）的M LL/AF9；t （1；11）的M LL/AF1q 。
第Ⅵ组t （9；22）的BCR/ABL ；t （9；12）的TEL/ABL 。
第Ⅶ组t （6；9）的DEK/CAN ；t （9；9）的SET/CAN ；EV1。
第Ⅷ组t （11；17）的PLZF/RAR α；t （15；17）的PM L/RAR α；t （2；5）的NPM /ALK ；t （5；17）的NPM /RAR α；t （3；5）的NPM /M LF1。
以上引物均由上海生物工程技术有限公司合成。
巢式第1轮PCR ：25μl 反应体系中，含有10×buffer 2.5μl ，25mmol/L M gCl 21.5μl ，10mmol/L dNTP 0.5μl ，外侧引物（5pmol/条）2.5μl ，cDNA 2.5μl ，Taq DNA 聚合酶1.25U 。
PCR 条件为：95℃5min ，95℃变性30s ，58℃退火30s ，72℃延伸1min 。
共25个循环，4℃保存。
巢式第2轮PCR 25μl 反应体系中，含有10×buffer 2.5μl ，25mmol/L M gCl 21.5μl ，10mmol/L dNTP 0.5μl ，内侧引物（5pmol/条）3.2μl ，第1轮PCR 产物2μl ，Taq DNA 聚合酶1.25U 。
PCR 条件为：95℃5min ，95℃变性30s ，58℃退火30s ，72℃延伸1min 。
共25个循环，72℃延伸10min ，4℃保存。
1.2.4分离PCR 上述多重巢式PCR 中的外、内侧引物均为包含数对引物的混合引物，可扩增出数种融合基因的剪接形式，对应片段的大小及其电泳的位置彼此接近。
因此，需要根据阳性条带组所含引物的对数，设立相应组数的分离PCR ，每组只加入一对引物，以确定第2轮巢式PCR 可疑阳性条带所对应的剪接形式。
反应体系（25μl）包括：10×buffer 2.5μl ，25mmol/L M gCl 21.5μl ，10mmol/L dNTP 0.5μl ，引物（5pmol/条）1μl ，第1轮产物2μl ，Taq DNA 聚合酶1U 。
反应条件与巢式第2轮PCR 相同。
1.2.5电泳和扫描1%琼脂糖凝胶电泳，BIO-RAD 凝胶成像系统观察、照相，对底片进行灰度扫描。
1.2.6染色体核型分析采用直接法、24h 培养法和同步法制备染色体，采用R 带或G 带技术显带。
根据《人类细胞遗传学国际命名体制（ISCN1995）》描述核型。
2结果２．１染色体核型分析60例均为正常核型。
男性为46，XY ；女性为46，XX 。
２．２多重巢式ＲＴ－ＰＣＲ结果经2轮巢式PCR 反应，在60例AM L 患者中，18例（30%）分别被检出存在PM L/RAR α、AM L1/ETO 、TLS/ERG 、CBF β/M YH11和M LL/AF9等5种融合基因异常，其中12例初诊均为M 3，多重巢式RT-PCR 检测发现9例具有PM L/RAR α融合基因，其余3例却具有AM L1/ETO 融合基因（图1）；4例M 4E O 显示具有CBF β/M YH11融合基因；2例诊断为M 2，检测具有M LL/AF9和TLS/ERG 融合基因。