用PCR扩增的方法鉴别不同物种来源的肌肉
一、特异性目的片段DNA的扩增
实验原理：
聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是体外酶促合成特异 DNA片段的一种方法，为最常用的分子生物学技术之一。

典型的
PCR 由（1）高温变性模板；（2）引物与模板退火；（3）引物沿模板延伸
三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的 DNA 得以迅速扩增。

其主要步骤是：将待扩增的模板DNA 置高温下（通常为 93℃-94℃）使
其变性解成单链；人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分
别与目的基因两侧的两条单链互补结合，两个引物在模板上结合的位置决
定了扩增片段的长短；耐热的 DNA 聚合酶（Taq酶）在72℃将单核苷酸
从引物的 3’端开始掺入，以目的基因为模板从 5’→3’方向延伸，合
成 DNA 的新互补链。

本实验采用物种特异性引物扩增的方法来鉴定 3 中不同物种来源的肌肉。

以不同物种来源的动物 DNA 为模板，用物种特异性的引物进行 PCR 扩增，只有在模板和引物的物种相对应的情况下才会有特异性条带的出现，其他条件下都不会出现特异性的条带。

应用此方法，可以特异性地检测样
品中痕量的特定 DNA 成分。

实验步骤：
1．不同反应体系的配制按以下体积将各成分分别加入一做好标记的无菌PCR 管中，配制 50μl PCR 反应体系，注意酶要最后加，加完后将 PCR
2．设定好 PCR 仪的反应程序。

将上述混合液稍加离心，立即置 PCR 仪上，盖紧热盖，执行扩增程序。

反应程序为：
预变性 94℃ 5min
变性 94℃ 5s
退火 50℃ 5s 30 次
延伸 72℃ 20s
后延伸 72℃ 5min
3．反应结束后，终止程序，将 PCR 管从 PCR 仪中取出，放置于 4℃待电泳检测。

二、电泳检测目的片段
实验原理：
核酸分子是两性解离分子，在高于其等电点的电泳缓冲液 (pH 8.0-8.3)中，其碱基不解离，而磷酸基团全部解离，核酸分子因而带负电荷，电泳时向正极迁移。

琼脂糖主要是从海洋植物琼脂中提取而来并经糖基化修饰，为一种聚合链线性分子，使用琼脂糖凝胶作为电泳支持介质，发挥分子筛功能，使得大小和构象不同的核酸分子的迁移率出现较大差异，从而达到分离的目的。

琼脂糖凝胶电泳操作简单、快速、通过调整其使用浓度，使得分辨率达到大多实验的要求。

因此成为分离、鉴定、纯化核酸分子的常用方法。

实验步骤：
1．称取 2.4 g 琼脂糖，放入一 250 ml 锥形瓶中，加入 120 ml 1×TAE 缓冲液，将瓶口用纸盖好，微波炉中高火加热约 40s 直至煮沸，摇动锥形瓶使琼脂糖分散，再重复煮沸 2 次，直到溶液清澈透明，看不到琼脂糖颗粒。

2．将制胶模具装好，插上合适齿孔的梳子，待煮好的琼脂糖温度降到 60℃左右时按照 1:20000 的浓度加入 Golden View。

混匀后倒入模具，静置，约 30-45min 后凝胶完全凝固。

3．琼脂糖凝胶完全凝固之后，轻轻地垂直拔出梳子，小心不要将胶孔破坏，将凝胶从模具中取出，放入电泳槽中，添加 1×TAE 缓冲液至刚好没过凝胶（注意凝胶有样品孔的一端靠近电泳槽的负极）。

4．取 10μl PCR 产物与 2μl 的 6×上样缓冲液混合均匀，加入到凝胶样品孔中，注意每加完一个样品，应更换一个吸头，以防污染，不要碰坏样品孔(注意：加样前要先记下加样的顺序)。

在每排样品孔中留出一个位置加入 5μl 的 marker。

5．加样后的凝胶板立即通电进行电泳，电压 180V，样品由负极(黑色)向正极 (红色)方向移动。

电压升高，琼脂糖凝胶的有效分离范围降低。

当溴酚蓝移动到距离凝胶下缘约剩 1/3 时，停止电泳。

6．电泳完毕后，取出凝胶，在紫外灯下观察，DNA 存在则显示出绿色荧光条带，采用凝胶成像系统拍照保存。

实验结果
从左至右第6条带为marker，1-6号试管产品分别对应1、2、3、4、5、8条带
实验分析
本次PCR实验周五组的14组实验全部以失败告终，可能的原因如下：
1.模板或引物的制备出现问题；配制的镁离子溶液浓度过低；Taq酶变性
失活；PCR反应条件控制不当。

2.忘记加某种成分，比如Taq酶；电泳条件控制不当。

理论结果：
出现两条明显的移动距离不同的条带，再根据加入引物的不同，可以判断出DNA为猪肉或者牛肉，另外一组没有明显条带的为兔肉。

也有可能出现预期没有的条带，原因如下：
引物与靶序列不完全互补；引物聚合形成二聚体；酶的纯度和量把握不准确；加入引物时，没有及时更换枪头，造成样品污染；电泳时上样操作不规范。

虽然本次实验结果不理想，但是我们依然学习到了PCR和电泳的基本原理和主要步骤，掌握了基本的操作方法，再次感谢老师和助教的指导和帮助。