通过检测标记基因的有无，来判断目的基因是 否导入受体细胞。
（1）抗药性筛选法： 菌株为某种抗生素缺陷型， 而质粒上带有该抗 性基因（如抗氨苄青霉素，抗卡拉霉素等）。 如何筛选出含有目的基因的受体细胞？
（这样只有转化子才能在含该抗生素的培养基 上长出。）
PStⅠ PStⅠ
外源基因连接
限制性内切酶 识别序列
如果外源 DNA插入， 氨卞青霉素 抗性基因失 活
标记基因
自主复制
进行筛选
pBR322质粒结构
（2） DNA分子杂交——检测转基因生物染色体 的DNA上是否插入了目的基因
过程:
①首先取出转基因生物的基因组DNA
②用含目的基因的DNA片段（单链）用放射性同 位素等作标记,以此做探针
③使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂 交带,表明染色体已插入染色体DNA中
④蛋白质
⑤环状RNA
⑦能“友好”地“借居”
③结构很小 ⑥环状DNA
A．①③⑤⑦ B．②④⑥ C．①③⑥⑦ D．②③⑥⑦
2．下列不是基因载体必须具备的条件的是 ( D )
A、能自我复制 B、有多个限制酶切点 C、具有标记基因 D、它是环状DNA
真核生物的基因结构
非编码区
与RNA聚合 酶结合位点
前体信使RNA
实例 1：
• 1、下列获取目的基因的方法中增目的基因 • C.反转录法 • D.通过DNA合成仪利用化学方法人工合成
（二）基因表达载体的构建—形成重组DNA分子
同一种
切割目的基因和质粒的限制酶是同一种限制酶吗？
目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并遗传 给下一代，使目的基因表达和发挥作用。
导入微生物细胞
将目的基因克隆到大肠
杆菌细胞中的操作步骤：
1)获得目的基因和质粒载体；
2)形成重组质粒； 3)制备感受态细胞，用重组质
粒转化大肠杆菌细胞； 4)培养大肠杆菌，让重组质粒
形成大量拷贝； 5)筛选含重组质粒的大肠杆菌
细胞。
导入植物细胞：土壤农杆菌转化法
土壤农杆菌：具有趋化性（酚），感染双目的基 因的
逆转录
单链
合成
双链DNA（目的基因）
mRNA
DNA
载入
载 体
导入 受体 细菌
扩增
产生
特定
分 离
性状
目 的 基 因
•化学合成——人工合成
•根据已知氨基酸序列直接合成DNA
蛋白质 氨基酸
推测
mRNA的 核苷酸
推测 结构基因 的核苷酸
序列
序列
序列（单
利用PCR技术扩增 已知序列：
用DNA合成仪人工合成从基因中获取目的基因• cDNA 法
供体 细胞 限 DNA 制
酶
许多 DNA 片段
载入
载 体
导入 受体 细菌
扩增
产生
特定
分 离
性状
目 的 基 因基因组DNA的构建将总DNA经过酶解，分离不同长短的DNA片段。包 含的基因组片段分别克隆在质粒或噬菌体载体上，转 染细菌或体外包基本工具有哪些？ • 2.基本工具的作用和特点分别是什么？ • 3.限制酶、DNA连接酶分别作用于DNA的
什么部位？ • 4.基因工程的基本步骤是什么？ • 5.获得目的基因的方式有哪些？
目的基因
1．质粒是基因工程最常用的运载体，它的主要特点
是：
( C)
①能自主复制 ②不能自主复制
㈣ 将目的基因导入受体细胞
目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳 定和表达的过程，称为转化。
常用的受体细胞：大肠杆菌、枯草杆菌、 土 壤农杆菌、酵母菌、动植物细胞等
（三）将重组DNA分子导入受体细胞
常用的受体细胞：
有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌 和动植物细胞等。
导入方式： 主要借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。
Kary B. Mullis
PCR的反应体系
模板：DNA 原料：四种 脱氧核苷酸； 酶：Taq酶（ TaqDNA聚合酶）嗜热细菌中分离
得到 引物：DNA片段 Mg2+（维持酶活性所必需） PCR缓冲液：维持PH恒定，保护Taq酶
PCR反应过程可分为三步：变性、退火、延伸
1．变性 双链模板DNA解离为单链结构。（90～95℃）
基 因 枪 法： 单子叶植物常用的一 种基因转化方法，但 成本较高。
花粉管通道法： 十分简便经济的 方法。我国的转 基因抗虫棉就是 用此方法获得。
将目的基因导入动物细胞
①方法：显微注射法
②程序：
重组DNA提纯
取卵（受精卵）
显微注射
受精卵发育
新性状动物
转基因动物
（四）目的基因的检测与鉴定 1.筛选含有目的基因的受体细胞
退火
第二次循环
延伸
第二次循环
㈡ PCR反应曲线
理论上，PCR反应产物呈指数增长，但这种增长形式在扩增2530个循环以后便放慢直至停止，达到反应平台。此时扩增产物 量不再随循环次数的增加而呈指数增长。
PCR仪程序设定
PCR的应用
• PCR具有省时、操作简便、特异性强、灵敏 度高、效率高、应用范围广等特点。PCR技 术在分子生物学、医学和案件侦破等领域 得到广泛应用。
DNA 双链
变性
DNA 单链
PCR反应过程可分为三步：变性、退火、延伸 2．退火 引物与模板互补成双链。 （55～60℃）
(由于引物浓度高，序列短，所以易与模板 结合。)
引物
PCR反应过程可分为三步：变性、退火、延伸 3．延伸 在Taq酶作用下，合成特异DNA序列。70～75℃
延伸
变性Βιβλιοθήκη 第二次循环链）•核苷酸序列已知，把将要合成的DNA序列 输入到DNA合成仪，用化学方法直接人工 合成
聚合酶链式反应
（PCR：Polymerase Chain Reaction)
PCR是由美国科学家穆利斯提出的一种 体外简化条件下模拟DNA体内复制的DNA 快速扩增的方法，此技术获得1993年诺贝 尔化学奖。
成熟的信使RNA
编码区
非编码区
第二节 基因工程的基本操作程序
基因工程的基本操作程序
（一）获得目的基因 （二）构建基因表达载体——形成重组DNA分子 （三）将目的基因导入受体细胞 （四）目的基因的检测与鉴定
（一）目的基因的获取：目的基因即我们所需要库）