动物细胞融合
姓名：学号：实验时间：2014.9.16
1.实验目的
a.了解动物细胞融合的常用方法
b.学习化学融合和电融合的基本操作过程
c.观察动物细胞融合过程中细胞的行为和变化
2.实验原理
细胞融合是指在自发或者诱导条件下，两个或两个以上细胞合并为双核或者多核细胞的过程。

聚乙二醇（PEG）能诱导细胞融合，改变细胞膜脂质分子的排列，去除这些物质后，细胞膜趋向于恢复原有的有序结构。

在恢复过程中相接触的细胞由于接口处脂质双分子层的相互亲和与表面张力，细胞膜融合，胞质流通，发生融合。

3.实验材料和用品
试剂：50%PEG液、鸡红细胞悬液、0.85%NaCl溶液、GKN液
器材：倒置显微镜、离心机、载玻片、盖玻片
4.实验步骤
a.取1ml鸡红细胞悬液+4ml 0.85%的NaCl溶液，进行以下两次离心处理：
1）1000r/min离心2分钟。

（去上清液，再加入至5ml的0.85%的NaCl溶液）2）1000r/min离心2分钟
b.将上步最后一次的沉降血球（去上清液后，约0.1~0.2ml)，加入GKN液至
1~2ml，使之成为10%的细胞悬液。

c.取上述10%的细胞悬液1ml，加入3mlGKN液。

d.取c中1ml+0.5ml 50%PEG液，c中0.5ml+0.5ml 50%PEG液，c中0.5ml+1ml
50%PEG液，混匀滴片，在常温下2~3分钟后，镜下观察。

5.实验结果
a.图片与解释
a.两个相接处的鸡血红细胞在PEG的诱导下细胞膜开始发生融合
b.发生部分细胞质融合的鸡血红细胞，此时细胞核尚未接触
c.细胞融合接近完成的鸡血红细胞，此时细胞核尚未完全融合
d.细胞核融合完成，细胞融合完成
b.三组对比实验结论：鸡血红细胞的融合率随PEG浓度的增加而增大
6.讨论与结论
a.视野中有较多细胞凝集成团，因为之前滴加溶液时没有混匀，以后要充分混匀溶液
b.有些细胞已经变形，因为反应后放置时间过长，以后要及时进行观察
c.细胞融合完成的最后阶段细胞是椭圆而非圆形，因为细胞融合整个过程太短，导致细胞膜没有回复原来的形状
d.细胞变形也有可能是受到PEG的影响，所以PEG浓度不应该太高
细胞融合应用
1.医学：
a.用于生产树突状细胞抗肿瘤疫苗
一般认为肿瘤细胞表面抗原不能诱导强的免疫应答反应，树突状细胞（dendritic cells,DCs）与肿瘤细胞融合形成的树突状细胞疫苗能够有效地激发机体的细胞免疫应答，无论是在动物研究还是在人体早期临床试验中都证明这是一种方便、安全、可行的方法。

并且由于融合细胞可以在体内存活，因此可以维持较长时期的免疫应答，有利于诱发机体产生有效的抗肿瘤免疫。

肿瘤抗原可以肽段或完整蛋白的形式与DCs结合，或者将肿瘤抗原基因转化进DCs中，使其内源性地表达抗原，这两种方法在抗肿瘤免疫应答中均有效，但适于免疫的肿瘤抗原及其基因难以鉴定从而限制了其应用，有实验证明用这两种方法制备的肿瘤疫苗的免疫原性不及肿瘤细胞与树突状细胞直接融合的异核细胞，融合细胞保持了DCs和肿瘤细胞的特性，并且能高效地将未知的肿瘤抗原提呈给免疫系统，今后肿瘤疫苗的研究工作将集中在疫苗的纯化上，以期用高度纯化的杂合细胞来激发更为有效和强烈的免疫应答反应，使得这种方法在临床应用中更为实际。

b. 用于生产单克隆抗体
使小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合形成能产生单克隆抗体（monoclonal antibody,McAb）的杂交瘤细胞，单克隆抗体具有专一性和灵敏性，作为理论研究的工具在病原检测和疾病治疗以及食品安全领域具有广阔的应用前景。

1985年，中科院上海细胞生物学研究所研制成功抗北京鸭红细胞和淋巴细胞表面抗原的单克隆抗体，同时还与有关医学部门合作，成功地制备了抗人肝癌和肺癌的单克隆抗体。

在神舟四号上我国自制的细胞电融合仪分别进行了植物细胞的电融合试验和动物细胞的电融合试验，动物细胞电融合实验采用纯化的乙肝疫苗病毒表面抗原免疫的小鼠B淋巴细胞和骨髓瘤细胞，目的是获得乙肝单克隆抗体。

目前有关单位利用McAb作用的专一性这一特点正在探索用“生物导弹”
对癌症进行早期诊断和治疗。

c.用于细胞疗法
SCNT将患者的任何体细胞与去核卵细胞融合，融合子进行有丝分裂形成囊胚，囊胚的内细胞团是多能干细胞，对多能干细胞进行诱导使其定向分化可形成所需的组织和器官用于器官移植，不仅解决了器官和组织来源问题，并且也避免了宿主对外来物的免疫排斥。

d.动物体细胞融合在基础理论研究方面的应用
(1)用于研究细胞的核质关系和个体发育。

20世纪70年代初，诞生了细胞拆合工程。

Carter于1967年发现细胞松弛素B（CB）能诱发体外培养的小鼠L细胞的排核作用。

Prescott等1972年首先应用离心术结合CB分离哺乳类细胞的胞质体获得成功，为研究哺乳类细胞的核、质相互关系、细胞质基因的转移开创了新的途径。

异核体和细胞杂合子被用来确定基因调节因子，这些调节因子决定一个细胞表型消失或得以保持以及赋予受体新性状；通过对供体和受体细胞所有细胞特异性基因表达研究，细胞融合有助于人们了解发育，特别是在研究基因编码的可逆性方面。

在个体发育过程中，血红蛋白存在着从胚胎型向胎儿型（幼虫）最终向成人型的转换，对这些转换进行研究，除了揭示基因顺序表达的调控机理外，在医学方面也有意义，人们可以部分或全部扭转从胚胎型向胎儿型的转变从而治疗镰刀型贫血病。

（2）用于揭示疾病发生的机制。

与其他技术结合使用，细胞融合是一种揭示疾病机理的有效方法。

例如，细胞融合与免疫荧光，生化分析，电镜技术相结合，Lattanzi G等对肌肉萎缩症发生的机理进行了研究。

（3）用于膜蛋白动力学研究。

细胞融合技术与显微镜技术结合使用被用来研究膜蛋白动力学以及这些膜蛋白之间的关系，Péter Nagy等的研究发现大型膜蛋白群之间(主要组织相容性复合物major histocompatibility complex,MHC，包括MHC Ⅰ和MHC Ⅱ）发生蛋白质交换，并且群内蛋白之间也发生蛋白移位，小蛋白群之间也存在着蛋白重排现象。

2.农业：
a. 体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统，在杂种的分裂和增殖过
程中双亲的叶绿体、线粒体DNA亦可发生重组，从而产生新的核外遗传系统。

b.融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离机制的限制，为远缘物种间的遗传物质
交换提供了有效途径。

3.生物：
a.用于基因定位和绘制人类基因图谱
JP2 杂种细胞中某一染色体或其片段的存在与否与细胞的某一性状表达与否相联系，从而可以实现把基因定位于某一染色体或某一区段上。

1967年Weise和Green发现在人和鼠的融合细胞中，人的染色体优先丢失，并证明利用这一特点有可能对人染色体上的基因进行定位。

1970年Ruddle等开始系统地用融合细胞作为实验系统来绘制人类基因图。

b.用于动物育种
体细胞核移植技术（somatic cell nuclear tran sfer technique,SCNT）是将细胞核移植到另一细胞的细胞质中的生物技术。

动物体细胞融合后，杂种细胞难以发育再生为一个个体，但借助于细胞核移植的方法将融合后杂种细胞的细胞核移入去核成熟卵内，可培育新的杂种。

另外，细胞核移植技术的建立，还为目前进行的哺乳动物体细胞克隆和转基因技术打下良好的实验基础。