• 流式细胞仪通过接 • 流收式激细光胞照仪射通后过液接流
不足： 区室化：细胞内膜包结构聚集 AM酯不完全水解 渗漏：有机离子载体、P糖蛋白多药载体等排除胞外
荧光探针的负载— AM酯负载
荧光探针的校准
离解常数Kd：将荧光信号转化为离子信号的关键转换参数 校准过程：记录对应于精确控制的离子浓度的荧光信号，
通过换算计算出解离常数Kd，
荧光探针技术检测Ca2+
钠绿 比SBFI对Na+的选择性更高 激发波长488nm，可替代Confocal和流式细胞仪进行检测 对细胞光损伤小
应用： 评估大鼠丘脑神经元持续Na+蓄积 检测缺氧诱导的神经元Na+内流
荧光探针技术检测Na+
CoroNa Red
CoroNa Red氯化物 细胞通透性酯 对Na+高选择性
如：Ca2+可使铬黑T由蓝变红，使钙盐指示剂 钙红从蓝变为酒红。
放射性标记法——放射性标记目标离子，如［45Ca］ 微电极法
荧光探针法
核磁共振法NMR
其他新技术
不同脲素浓度下, 通过监测1H, 15N信号强度变化监控 MMP-12 折叠过程
生物芯片技术
其他新技术
荧光强度反应荧光标记抗体与相应抗原结合程度
Luis A. Rivas, et.al. A 200-Antibody Microarray Biochip for Environmental Monitoring: Searching for Universal Microbial Biomarkers through Immunoprofiling
可见光激发的荧光Ca2+探针
高亲和力的钙探针：
Fluo-3、Fluo-4、Rhod-2和相关的衍生物
基于Fluo-3和Rhod-2的低亲和力的钙探针：
Fluo-5F、Fluo-4FF、Fluo-5N、Mag-Fluo-4、Rhod-5N
钙绿Calcium Green、钙橙Calcium Orange、钙深红
细胞膜电位检测
细胞凋亡时，膜电位改变，膜结合荧光探针的强度反应细胞凋亡程度
Jihoon Kim,et.al. Rapid Cytotoxicity Screening Platform for Amyloid Inhibitors Using a Membrane-Potential Sensitive Fluorescent Probe
荧光探针技术检测其它离子
荧光Cl－探针：6-甲氧基喹啉衍生物SPQ 检测原理：经扩散限制的碰撞淬灭 应用：
用于检测CFTR活性 其他转运蛋白，如GABAA、红细胞Cl－／HCO3交换器等
荧光探针技术检测其他离子 氰化物 硫化物、亚硫酸根、硫酸根、硫代硫酸根 亚硝酸根、硝酸跟和一氧化氮 磷酸根和焦磷酸根 硒
Fura-4F、Fura-5F、Fura-6F、Fura-FF、Indo-5F
低亲和力的钙探针：
BTC／BTC-AM，Mag-Fura-2、Mag-Fura-5、Mag-Indo-1
金鸡纳皮素（Quin）-2和Quin-2 AM
吸收率和量子产率比低，主要用来耗竭胞质液中游离Ca2+，确保 单向性Ca2+内流
用于测定近中性pH的荧光探针
荧光素黄 —— 中性pH测定首选 发射波长较长、量子产率高 易从细胞内流失
荧光素黄衍生物
BCECF－ 2`,7`-二(2-羧乙基)-5(6)-羧基荧光素
不易透过细胞膜 pKa=6.98,更适于生理条件下pH的测定
SNAFLs－半萘酚荧光素类 pKa在7.6－7.9范围内均发生漂移,可用比率法测定体系的 pH值
荧光探针强度检测方法的选择 激光共聚焦显微镜 流式细胞仪 双波长荧光光度计
激光共聚焦显微镜（LSCM）
光学检测
--荧光显微镜/激光共聚焦
优点： 样本兼容性强， 定性、 定位分析 缺点： 分析速度慢， 参数少， 难以定量
LSCM探针选择
荧光探针与研究的结构有密切关系 选择荧光强度较强的探针 同时应用多种荧光探针时，避免发射光谱重叠 荧光探针溶剂对荧光强度无影响 如组织需固定，选择耐受固定剂的荧光探针
Calcium Crimson探针
Fura Red探针 钙黄绿素Calcein
荧光Ca2+探针交联物
葡聚糖交联物：Fura、Fluo-4和Indo葡聚糖 水溶性，低毒性，无生物活性 抵抗内源性糖苷酶的裂解 极少区室化 很好的存在于活细胞内
亲脂性衍生物：Fura-C18、Fura-FF-C18和钙绿-C18 与膜表面结合，检测局部浓度变化
DNA标记
通过X－Ray检测口服有机硅修饰PI荧光探针的口服吸收过程
Michihiro Nakamura, et.al.Thiol-Organosilica Particles Internally Functionalized with Propidium Iodide as a Multicolor Fluorescence and X‐ray Computed Tomography Probe and Application for Non-Invasive Functional Gastrointestinal Tract Imaging
应用：
对细胞的Na+内流产生敏感反应 测定培养的上皮细胞和人肺组织气管气道表面液体
SBFI荧光探针技术检测Na+
Control
TTX
TTX阻断Na+通道，Na+荧光探针标记Na+，膜Na+电位紊乱
Christophe M. Lamy,et.al. Sodium Sensing in Neurons with a Dendrimer-Based Nanoprobe
荧光探针技术检测pH
荧光探针技术检测pH
细胞内胞质液pH常为6.8－7.4，而酸性细胞器内pH则 为4.5－6.0
细胞内pH值可部分发生改变，而且速度相当慢
荧光pH探针可有效检测不同生理和病理过程中pH变化 生理范围的pH测定－SNARF、SNAFL 酸性细胞器的pH测定－LysoSensor探针
Chenye Yang,et.al. Continuous Fluorescence Imaging of Intracellular Calcium by Use of Ion-Selective Nanospheres with Adjustable Spectra
荧光探针技术检测Na+、K+及 其它离子
荧光探针测定细胞内离子 浓度技术
陶亮 中山医学院药理教研室
细胞内离子
Na+
cytoplasm
Ca2+
ClFe2+
K+
细胞内离子的生理功能
细胞结构的组成成分
血红蛋白中Fe2+、超氧化物歧化酶中Cu2+
维持细胞膜电位
K+、Cl-、Na+ 、Ca2+
维持胞内外渗透压
Na+
协同转运葡萄糖等营养物质 排泄代谢产物
荧光探针技术检测Na+和K+
SBFI和PBFI及其AM酯：苯并呋喃基荧光团连接到一种冠醚 螯合剂
SBFI：对Na+选择性强 PBFI：对K+选择性强
SBFI和PBFI的应用： SBPI用于测定分离线粒体的Na+梯度或不同组织和细胞内Na+
水平或Na+外流 PBFI用于测定K+外流与细胞凋亡间关系
荧光探针技术检测Na+
细胞间通讯GJIC检测
标记活细胞线粒体
线粒体荧光探针
骨架蛋白
Merge
Abhik Mallick,et.al. Dual Drug Conjugated Nanoparticle for Simultaneous Targeting of Mitochondria and Nucleus in Cancer Cells
组织中蛋白质和酯类在紫外线照射下发出微弱的淡蓝色荧光； 诱发荧光：组织与荧光色素结合后，经一定波长的光线照射后发出 的荧光
荧光探针：常用的诱发荧光，能产生荧光的生物染色剂称之为荧光
染料或荧光探针
荧光探针技术的应用
pH测定
pH在6.0-8.0时，不同pH值，荧光探针具有不同荧光强度
Guoliang Ke,et.al. A Cell-Surface-Anchored Ratiometric Fluorescent Probe for Extracellular pH Sensing
生物性发光Ca2+探针
水母素、重组水母素及其衍生物
从发光的水母和其他海洋生物中分离得到的发光蛋白 优点：
可排除自发荧光的干扰 不渗出，不分泌 不发生区室化或细胞内隔离 检测长期间内Ca2+变化
Fluo-4荧光探针检测Ca2+
Bright-Field
Fluo-4 fluorescence
Merge
AM酯负载 酸负载 ATP－诱导渗透 阳离子脂质体递送 电穿孔 低渗休克
单细胞负载 —— 显微注射法
膜片钳技术 微量电泳法 压力注射法
荧光探针的负载— AM酯负载
AM负载技术：Ca2+及其它阳离子探针的羧基和PH探针的 酚 羟基被分别衍生为乙酰甲酯或乙酸酯，使探针可透过细 胞膜并对离子不敏感，一旦进入细胞内，这些衍生的探针 就可被普遍存在的细胞内酯酶水解，释放出离子敏感的多 阴离子探针
荧光探针
荧光：某些物质吸收了与它本身特征频率相同的光量子后，其原子