实验报告
课程名称： 植物生理学实验 指导老师： 成绩：__________________ 实验名称： 叶绿体色素的提取、分离、理化性质和叶绿素含量的测定 实验类型： 同组学生姓名：
一、实验目的和要求（必填） 二、实验内容和原理（必填）
三、实验材料与试剂（必填） 四、实验器材与仪器（必填）
五、操作方法和实验步骤（必填） 六、实验数据记录和处理
七、实验结果与分析（必填） 八、讨论、心得
一、 实验目的和要求：
1． 掌握植物中叶绿体色素的提取分离和性质鉴定。
2． 掌握定量分析的原理和方法。
二、 实验内容和原理：
以青菜为材料，提取和分离叶绿体色素并进行理化性质测定和叶绿素含量分析。
原理如下：
1．叶绿素和类胡萝卜素均不溶于水而溶于有机溶剂，常用95%的乙醇或80%的丙酮提取。
2．皂化反应。
叶绿素是二羧酸酯，与强碱反应，形成绿色的可溶性叶绿素盐，就可与有机溶剂中的类胡萝卜素分开。
3．取代反应。
在酸性或加温条件下，叶绿素卟啉环中的Mg2+,可依次被H+和Cu2+取代形成褐色的去镁叶绿素和绿色的铜代叶绿素。
4．叶绿素受光激发，可发出红色荧光，反射光下可见红色荧光。
5．定量分析。
叶绿素吸收红光和蓝紫光，红光区可用于定量分析，其中645和663用于定量叶绿素a,b 及总量，而652可直接用于总量分析。
三、实验材料与试剂
材料：青菜叶
试剂：KOH 固体、醋酸铜粉末、醋酸
四、主要仪器设备：
1．天平（万分之一）、可扫描分光光度计、离心机
2．研具、PE 管、酒精灯等
五、操作方法和实验步骤（必填）
1．定性分析：
荧光现象：鲜叶3-5g+95%乙醇15ml （逐步加入）,磨成匀浆 ，过滤入三角瓶，观察荧光现象 皂化反应： 加KOH 数片剧烈摇均，加石油醚1ml 和H 2O 1ml ，分层后观察
取代反应：加醋酸约1ml ，观察颜色，取1/2加醋酸铜粉，加热变 亮绿 色
2．叶绿素和类胡萝卜素的吸收光谱测定：
皂化反应的上层黄色石油醚溶液（稀释470nm OD 0.5-1） ，在400-700nm 处扫描光谱，分别测定类胡萝卜素的吸收峰
反复用石油醚粹取,直到无类胡萝卜素,离心得叶绿素(盐)，（稀释663nm OD 0.5-1） ，分别测定叶绿素的吸收峰
3．叶绿素定量分析：
鲜叶0.1g ，加1.9mlH 2O ，磨成匀浆，取2份0.2ml 加80%丙酮4.8ml,摇匀，4000转离心3min,上清液在645，652，663测定OD ，计算Chla,Chlb 和Chl 总量的值。
六、实验数据记录和处理
1．荧光现象：透射光 绿 色，反射光 红 光 装 订 线
2．皂化反应：上层呈黄色，为类胡萝卜素，吸收蓝紫光。
下层呈绿色。
为叶绿素。
吸收蓝紫光和红光。
皂化反应分层
3. 类胡萝卜素和叶绿素的吸收光谱测定：
上层黄色溶液扫描光谱
吸收峰为468nm、439nm、413nm、667nm和606nm 五个
下层绿色溶液扫描光谱
吸收峰为414nm、526nm、639nm三个
4．取代反应：
加醋酸约1ml，变褐（去镁叶绿素）
取1/2加醋酸铜粉加热变亮绿色，为铜代叶绿素。
去镁叶绿素铜代叶绿素
波长/nm 吸光度（第一组）吸光度（第二组）
645 0.068 0.072
652 0.093 0.095
663 0.164 0.170
根据公式：
C a(mg/L)=12.7OD663-2.69 OD645
C b(mg/L)=22.9OD645-4.68 OD663
C T(mg/L)= OD652?1000/34.5
Chla含量(mg/g.FW)= （C a(mg/L)/1000）?2/ 0.1 ?5/ 0.2
Chlb含量(mg/g.FW) = （C b(mg/L)/1000）?2/ 0.1 ?5/ 0.2
Chl总含量(mg/g.FW) = （C T(mg/L)/1000）?2/ 0.1 ?5/ 0.2
求得：
C a1= 1.899 mg/L C a2=1.965 mg/L
C b1=0.790 mg/L C b2=0.853 mg/L
C T1=2.696 mg/L C T2=2.754 mg/L
Chla含量1 =0.950 mg/g.FW Chla含量1 =0.982 mg/g.FW
Chlb含量 1 =0.395 mg/g.FW Chlb含量 1=0.426 mg/g.FW
Chl总含量1=1.348 mg/g.FW Chl总含量1=1.377 mg/g.FW
七、实验结果与分析
类胡萝卜素和叶绿素的吸收光谱测定：
类胡萝卜素的吸收峰为蓝紫光区468nm、439nm、413nm三个峰，在红光区667nm和606nm 的峰说明叶绿素有残留。
叶绿素在蓝紫光区有414nm、526nm两个峰，在红光区有639nm一个峰，蓝紫光区的峰比红光区的高，说明叶绿素吸收蓝紫光的能力比红光强。
叶绿素含量测定：
Chla含量1 =0.950 mg/g.FW Chla含量1 =0.982 mg/g.FW
Chlb含量 1 =0.395 mg/g.FW Chlb含量 1=0.426 mg/g.FW
Chl总含量1=1.348 mg/g.FW Chl总含量1=1.377 mg/g.FW
两组测定结果中叶绿素a与叶绿素b含量之和与用663nm求得的总叶绿素含量比较接近，说明实验结果较为理想，可能造成实验误差的因素有：
1.研磨后的叶绿素溶液中仍存在固体，可能堵塞移液枪管口，造成吸入的溶液量不准确
2.比色皿未清洗干净，造成测得的吸光度改变
3.分光光度计存在仪器误差
八、讨论、心得
思考题：
1．为什么叶绿素吸收红光和蓝紫紫光？
叶绿素的能级有基态（G），第一单线激发态（E1），第二单线激发态（E2）和三线激发态（E3），光子吸收必须遵守普朗克定律，被吸收光子的能量必须等于基态和激发态的能量差。
蓝紫光能量大，可使叶绿素分子中的电子跃迁到E2，而红光能量小，只能使其跃迁到E1，故叶绿素只能吸收蓝紫光和红光。
2．为什么可用皂化后的叶绿素盐来测定叶绿素的吸收光谱？
因为由于叶绿素皂化反应后的叶绿素盐并不影响叶绿素分子的骨架结构，叶绿素对光的吸收规律与叶绿素盐对光的吸收规律几乎是相同的，而且皂化反应可以从叶绿体色素中只筛选出叶绿素，排除了其他色素的干扰，所以可用皂化后的叶绿素盐来测定叶绿素的吸收光谱。
讨论：
1.皂化反应后的黄色溶液需用石油醚萃取多次，如果萃取补充分，会有叶绿素残留，在扫描吸收光谱
时除了在468nm、439nm、413nm有吸收峰，在667nm和606nm也会有微弱的叶绿素吸收峰。
2.在测定用皂化反应分离的叶绿素和类胡萝卜素的吸收光谱前，需将溶液稀释至
（470nm/663nm）OD在0.5-1之间，如果浓度过高，峰值可能会超出仪器的测量范围，将无法测得吸收峰。